DNA上での蛋白質相互作用を促進するHMGによるDNA変形の構造解析

HMG 促进 DNA 上蛋白质相互作用的 DNA 变形结构分析

• 批准号: 12034209
• 负责人: 楯 真一
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034209/
• 关键词: NMR; HMG-1; 2; HMG-I; マジック角試料回転; 液晶利用NMR

1.HMG2Aの立体構造解析HMG2蛋白質のN末端側HMG-boxであるAドメインの立体構造解析を完了した。サンプルの安定性・溶解性を改善するために徹底的にサンプル溶液の条件を検討した。最終的に0.1M Na_2SO_4の条件で十分な質のNMRデータを得ることができ現在までに定法どおりのNOEと2面角情報に基づいた立体構造解析を終了している。今後は、さらに精密化を進めるために残余双極子効果を利用した精密化を行う予定である。2.HMG2全長のDNAとの相互作用様式の解析HMG2の全長は2つのHMG-boxと1つの短いリンカーよりなっている。NMRによる構造解析を行うには、DNAに対する結合能が低すぎるために安定な複合体を形成しないため、NMRによる解析に耐える複合体サンプル調製は困難であった。そこで本研究では、CDによりDNA変形能の解析を行うことに計画を変更した。CDによる解析の結果、HMG-box単独ではDNAをkinkさせるが2つのHMG-box(AおよびB)がリンカーにより結び付けられた全長HMG2ではCDパターンからHMG2全長と相互作用したDNAは、あたかもヌクレオソーム中のDNAのような変形構造を持つことが明らかとなった。このことから、HMG2全長は明らかにHMG-boxとは異なるDNA構造変形能を有し、HMG2全長構造としてはじめてDNAシャペロンとしての機能を発揮する可能性を示した。3.HMG-I(2/3)とDNA複合体の構造解析HMG-I(2/3)が結合するDNA(PRDII-NRDI)のNMRシグナル帰属を完了した。また、HMG-I(2/3)-DNA複合体中でのDNAシグナルの帰属も完了し、相互作用部位のminor grooveに特異的なシグナル変化が観測されHMG-Iが認識するDNA側の部位を特定することができた。また、安定同位体標識したHMG-I(2/3)を調製し複合体中での蛋白質側のNMRシグナル帰属のためのデータ集積を完了した。DNAとの相互作用によりアミドプロトンの溶媒との交換が促進される関係で一部帰属が困難な部分があり完全シグナル帰属を完了できていない。複合体調製に関しては安定に行える条件を確立したので、さらにサンプル濃度をあげて完全なシグナル帰属を完了することを目指す。4.定量的な残余双極子効果観測手法の確立HMG2Aドメインの構造精密化およびHMG-I(2/3)-DNA複合体構造の精密化を行うために、すでにHMG2Bの精密化で利用した残余双極子効果の利用を計画している。基本的な測定法はすでに確立されているが、特に蛋白質DNA複合体のような複雑な系に適用する場合には液晶分子の共存の有無による微妙な構造変化や化学シフト変化などにより観測される残余双極子効果の定量性を損ねる恐れがある。そこで本年度の研究中ではマジック角試料回転法を溶液試料に適用することで定量性を向上させる方法を確立した。

1. HMG2A 的三维结构分析 我们完成了 A 结构域的三维结构分析，A 结构域是 HMG2 蛋白的 N 端 HMG-box。我们彻底研究了样品溶液条件，以提高样品稳定性和溶解度。最终，我们在0.1M Na_2SO_4条件下获得了足够质量的NMR数据，并按照标准方法完成了基于NOE和二面角信息的3D结构分析。未来，我们计划利用残余偶极子效应进一步完善该方法。 2.全长HMG2与DNA相互作用模式分析全长HMG2由2个HMG-box和1个短连接子组成。对于NMR结构分析来说，制备能够承受NMR分析的复杂样品一直很困难，因为与DNA的结合能力太低而无法形成稳定的复合物。因此，在本研究中，我们改变了使用CD分析DNA变形能力的计划。 CD 分析的结果是，HMG-box 单独引起 DNA 扭结，但在全长 HMG2 的情况下，其中两个 HMG-box（A 和 B）通过连接子连接，CD 模式显示 DNA与全长 HMG2 的相互作用似乎是在核小体中。已经表明这种材料具有与 DNA 相似的变形结构。这些结果表明，全长HMG2明显具有与HMG-box不同的DNA结构变形能力，并且全长HMG2结构可能首次充当DNA伴侣。 3. HMG-I(2/3)和DNA复合物的结构分析我们完成了HMG-I(2/3)结合的DNA(PRDII-NRDI)的NMR信号分配。此外，HMG-I(2/3)-DNA复合物中DNA信号的分配已经完成，在相互作用位点的小沟处观察到了特异的信号变化，该位点是DNA侧识别的位点通过HMG-I能够识别。我们还制备了稳定同位素标记的 HMG-I (2/3)，并完成了复合物蛋白质侧 NMR 信号归属的数据收集。由于与DNA的相互作用促进了酰胺质子与溶剂的交换，因此有一些部分难以分配，并且尚未完成完整的信号分配。现在我们已经建立了复杂制备的稳定条件，我们的目标是进一步提高样品浓度并完成信号分配。 4. 定量残余偶极效应观测方法的建立为了精制HMG2A结构域和HMG-I(2/3)-DNA复合物结构，我们正在计划使用已经在HMG2B精制中使用的残差。利用偶极子效应。基本测量方法已经建立，但特别是当应用于蛋白质-DNA复合物等复杂系统时，可以观察到由于液晶分子的存在或不存在而引起的细微结构变化和化学位移变化，这可能会损害定量性质。残余偶极子效应。因此，在今年的研究中，我们建立了一种通过将魔角样本旋转方法应用于溶液样本来提高定量性能的方法。

项目成果

T.Yoshida,S.Uchiyama,H.Nakano,H.Kashimori,H.Kijima,T.Ohshima,Y.Saibara,T.Ishino,H.Shimahara,T.Yoshida,K.Yokose,T.Ohkubo,A.Kaji and Y.Kobayashi: "Solution Structure of the Ribosome Recycling Factor from Aquifex aeolicus"Biochemistry,. (in press). (2001)

T.吉田、S.Uchiyama、H.Nakano、H.Kashimori、H.Kijima、T.Ohshima、Y.Saibara、T.Ishino、H.Shimahara、T.Yoshida、K.Yokose、T.Ohkubo、A.

N.Shimba,E.Kariya,S.Tate,H.Kaji,and M.Kainosho: "Structural comparison between wild-type and P25S human cystatin A by NMR spectroscopy. Does thismutation affect the α-helix conformation?,"Journal of structural and functional genomics. 6. 26-42 (2000)

N. Shimba、E. Kariya、S. Tate、H. Kaji 和 M. Kainosho：“通过 NMR 光谱法对野生型和 P25S 人半胱氨酸蛋白酶抑制剂 A 进行结构比较。这种突变是否会影响 α-螺旋构象？”结构和功能基因组学。6. 26-42 (2000)

N.Tjandra,S.Tate,A.Ono,M.Kainosho,and A.Bax: "The NMR structure of a DNA dodecamer in an aqueous dilute liquid crystalline phase"Journal of American Chemical Society. 122. 6190-6200 (2000)

N.Tjandra、S.Tate、A.Ono、M.Kainosho 和 A.Bax：“水性稀液晶相中 DNA 十二聚体的 NMR 结构”美国化学会杂志。

N.Utsunomiya-Tate,K.Kubo,S.Tate,M.Kainosho,E.Katayama,K.Nakajima,and K.Mikoshiba: "Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inihibited by the function-blocking CR-50 antibody"Proc.Natl.Acad.Sci.. 97. 9729-9734 (2000)

N.Utsunomiya-Tate、K.Kubo、S.Tate、M.Kainosho、E.Katayama、K.Nakajima 和 K.Mikoshiba：“Reelin 分子组装在一起形成一个大的蛋白质复合物，该复合物受到以下功能的抑制：