DNA上での蛋白質相互作用を促進するHMGによるDNA変形の構造解析

HMG 促进 DNA 上蛋白质相互作用的 DNA 变形结构分析

• 批准号: 12034209
• 负责人: 楯 真一
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034209/
• 关键词: NMR; HMG-1; 2; HMG-I; マジック角試料回転; 液晶利用NMR

1.HMG2Aの立体構造解析HMG2蛋白質のN末端側HMG-boxであるAドメインの立体構造解析を完了した。サンプルの安定性・溶解性を改善するために徹底的にサンプル溶液の条件を検討した。最終的に0.1M Na_2SO_4の条件で十分な質のNMRデータを得ることができ現在までに定法どおりのNOEと2面角情報に基づいた立体構造解析を終了している。今後は、さらに精密化を進めるために残余双極子効果を利用した精密化を行う予定である。2.HMG2全長のDNAとの相互作用様式の解析HMG2の全長は2つのHMG-boxと1つの短いリンカーよりなっている。NMRによる構造解析を行うには、DNAに対する結合能が低すぎるために安定な複合体を形成しないため、NMRによる解析に耐える複合体サンプル調製は困難であった。そこで本研究では、CDによりDNA変形能の解析を行うことに計画を変更した。CDによる解析の結果、HMG-box単独ではDNAをkinkさせるが2つのHMG-box(AおよびB)がリンカーにより結び付けられた全長HMG2ではCDパターンからHMG2全長と相互作用したDNAは、あたかもヌクレオソーム中のDNAのような変形構造を持つことが明らかとなった。このことから、HMG2全長は明らかにHMG-boxとは異なるDNA構造変形能を有し、HMG2全長構造としてはじめてDNAシャペロンとしての機能を発揮する可能性を示した。3.HMG-I(2/3)とDNA複合体の構造解析HMG-I(2/3)が結合するDNA(PRDII-NRDI)のNMRシグナル帰属を完了した。また、HMG-I(2/3)-DNA複合体中でのDNAシグナルの帰属も完了し、相互作用部位のminor grooveに特異的なシグナル変化が観測されHMG-Iが認識するDNA側の部位を特定することができた。また、安定同位体標識したHMG-I(2/3)を調製し複合体中での蛋白質側のNMRシグナル帰属のためのデータ集積を完了した。DNAとの相互作用によりアミドプロトンの溶媒との交換が促進される関係で一部帰属が困難な部分があり完全シグナル帰属を完了できていない。複合体調製に関しては安定に行える条件を確立したので、さらにサンプル濃度をあげて完全なシグナル帰属を完了することを目指す。4.定量的な残余双極子効果観測手法の確立HMG2Aドメインの構造精密化およびHMG-I(2/3)-DNA複合体構造の精密化を行うために、すでにHMG2Bの精密化で利用した残余双極子効果の利用を計画している。基本的な測定法はすでに確立されているが、特に蛋白質DNA複合体のような複雑な系に適用する場合には液晶分子の共存の有無による微妙な構造変化や化学シフト変化などにより観測される残余双極子効果の定量性を損ねる恐れがある。そこで本年度の研究中ではマジック角試料回転法を溶液試料に適用することで定量性を向上させる方法を確立した。

1。HMG2A的结构分析完成了A域的空间分析，即HMG2蛋白的N末端HMG-box。彻底检查样品溶液的条件，以提高样品的稳定性和溶解度。最后，可以在0.1M Na_2SO_4的条件下获得足够的质量NMR数据，并且迄今为止，我们已经基于标准NOE和二面角信息完成了3D结构分析。将来，我们计划使用残留偶极效应实施改进，以进一步完善改进。 2。与全长DNA的相互作用模式分析HMG2的总长度由两个HMG盒和一个短接头组成。对于NMR结构分析，稳定的复合物不会形成，因为DNA的结合能力太低，因此很难制备可以承受NMR分析的复杂样品。因此，在这项研究中，我们更改了使用CD分析DNA可变形性的计划。由于CD分析的结果，揭示了在单独的HMG-box中，DNA被扭结，但是在全长HMG2中，两个HMG盒（A和B）通过接头链接了两个HMG盒（A和B），与CD模式的全长HMG2相互作用的DNA与CD模式的全长HMG2相互作用具有类似于核瘤中DNA的修饰结构。这表明HMG2总长度显然具有与HMG-Box不同的DNA结构转换能力，并且HMG2全长结构可能首次可以作为DNA伴侣发挥作用。 3.与HMG-I（2/3）NMR信号分配DNA（pRDII-NRDI）与HMG-I（2/3）的结构分析已完成。此外，在HMG-I（2/3）-DNA复合物中分配了DNA信号，并且观察到相互作用位点的次要凹槽的特定信号变化，从而可以鉴定由HMG-I识别的DNA侧位点。此外，准备稳定的同位素标记的HMG-I（2/3），以完成复合物中蛋白质端NMR信号分配的数据积累。由于与DNA的相互作用促进了酰胺质子与溶剂的交换，因此某些部分很难分配，并且尚未完成完整的信号分配。通过建立稳定的复杂准备条件，我们旨在进一步增加样品浓度以完成完整的信号分配。 4。建立定量的残留偶极效应观察方法，以完善HMG2A结构域的结构和HMG-I（2/3）-DNA复合物的结构，我们已经计划在HMG2B的改进中使用残留的偶极效应。尽管已经建立了基本的测量方法，但是当应用于蛋白质DNA复合物等复杂系统时，由于存在或不存在液晶分子而导致的微妙结构变化和化学移位变化可能会损害观察到的残留偶极效应的定量性。因此，在今年的研究中，我们建立了一种通过将魔法角样品旋转方法应用于溶液样品来提高定量性的方法。

项目成果

T.Yoshida,S.Uchiyama,H.Nakano,H.Kashimori,H.Kijima,T.Ohshima,Y.Saibara,T.Ishino,H.Shimahara,T.Yoshida,K.Yokose,T.Ohkubo,A.Kaji and Y.Kobayashi: "Solution Structure of the Ribosome Recycling Factor from Aquifex aeolicus"Biochemistry,. (in press). (2001)

T.吉田、S.Uchiyama、H.Nakano、H.Kashimori、H.Kijima、T.Ohshima、Y.Saibara、T.Ishino、H.Shimahara、T.Yoshida、K.Yokose、T.Ohkubo、A.

N.Shimba,E.Kariya,S.Tate,H.Kaji,and M.Kainosho: "Structural comparison between wild-type and P25S human cystatin A by NMR spectroscopy. Does thismutation affect the α-helix conformation?,"Journal of structural and functional genomics. 6. 26-42 (2000)

N. Shimba、E. Kariya、S. Tate、H. Kaji 和 M. Kainosho：“通过 NMR 光谱法对野生型和 P25S 人半胱氨酸蛋白酶抑制剂 A 进行结构比较。这种突变是否会影响 α-螺旋构象？”结构和功能基因组学。6. 26-42 (2000)

N.Tjandra,S.Tate,A.Ono,M.Kainosho,and A.Bax: "The NMR structure of a DNA dodecamer in an aqueous dilute liquid crystalline phase"Journal of American Chemical Society. 122. 6190-6200 (2000)

N.Tjandra、S.Tate、A.Ono、M.Kainosho 和 A.Bax：“水性稀液晶相中 DNA 十二聚体的 NMR 结构”美国化学会杂志。

N.Utsunomiya-Tate,K.Kubo,S.Tate,M.Kainosho,E.Katayama,K.Nakajima,and K.Mikoshiba: "Reelin molecules assemble together to form a large protein complex, which is inihibited by the function-blocking CR-50 antibody"Proc.Natl.Acad.Sci.. 97. 9729-9734 (2000)

N.Utsunomiya-Tate、K.Kubo、S.Tate、M.Kainosho、E.Katayama、K.Nakajima 和 K.Mikoshiba：“Reelin 分子组装在一起形成一个大的蛋白质复合物，该复合物受到以下功能的抑制：