異方性スピン相互作用利用新規NMR法によるイオンチャネルの分子形態変化解析

使用各向异性自旋相互作用的新 NMR 方法分析离子通道中的分子形状变化

• 批准号: 19036016
• 负责人: 楯 真一
• 金额: $ 3.9万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19036016/
• 关键词: NMR; 膜タンパク質; 分子形態変化; 安定同位体; 安定同位体利用; タンパク質構造変化解析; 高磁場利用; イオンチャネル; 化学シフト異方性効果

本年度は, 以下の研究を行った.1) イオンチャネルタンパク質KcsAのミセル再構成系の確立 : 大腸菌により大量発現させたKcsAの完全長タンパク質をSDSミセルに4量体として再構成した状態でNMR測定可能な試料の大量調製法を確立した.2) イオンチャネルタンパク質の分子形態変化技術を目指した測定技術の確立 : SDSミセルにより再構成されたKcsAの分子量は約100kDaになるが, この状態での分子形態変化観測を行うために, われわれが開発してきたDIORITE法の適用が必要である. DIORITE法で解析の前提となる, タンパク質の分子配向状態を実現するために, アクリルアミドゲル中で最適な分子配向を実現する条件の検討と, 構造解析法の検討が必要であった. このために, MBP(40kDa)をモデル系として, MBPのリガンド結合に伴う分子形態変化を観測する技術を確立することを目指した. この結果, MBPを磁場に対して適切に分子配向させる試料調製条件を確立し, 実際にDIORITE法を用いたリガンド依存的なMBPの分子形態変化の観測に成功した. タンパク質の分子配向依存的に変化するTROSYシグナル変化のみから, MBP中のドメイン間相対配向の変化を定量的に解析することが可能となった. この研究の中で確立した技術により, KcsAを対象とした分子形態変化観測の準備が完了した.3) KcsAの全長再構成系における主鎖シグナルの帰属 : 2H/15N/13Cで標識したKcsAのSDSミセル再構成試料を調製し, Trosy 3重共鳴スペクトルの測定を行った. 主鎖のシグナル解析・DIORITE法による分子形態変化観測は, 今後順次進めてゆく.

1）建立用于离子通道蛋白KCSA的胶束重建系统：我们建立了一种方法，以准备NMR可衡量的样品，并用全长的KCSA蛋白在Escherichia coli中大量表达的NMR可衡量样品在SDS莫雷斯（SDS Micelles）中以较高的方式重新建立了sds of的莫雷斯。蛋白质：SDS胶束重建的KCSA的分子量约为100 kDa，但是为了观察到这种状态下的分子形态变化，我们已经开发的Diorite方法是必要的。为了实现蛋白质的分子取向状态，diorite方法是进行分析的前提，有必要研究在丙烯酰胺凝胶中实现最佳分子方向的条件并研究结构分析方法。因此，我们将MBP（40 kDa）用作模型系统。我们旨在建立一种技术来观察与MBP配体结合相关的分子形态变化。结果，我们建立了样品制备条件，使MBP与磁场正确对齐，并能够使用diorite方法实际观察MBP中配体依赖的分子形态变化。仅基于仅基于trosy信号的变化，分子取决于蛋白质的变化，可以定量分析Mbps中域间取向的相对方向的变化。这项研究中建立的技术完成了KCSA分子形态变化的观察的准备。3）KCSA的全长重建系统中主链信号的分配：我们准备了一个标记为2H/15N/13C标记的KCSA的SDS胶束样品，并用2H/15N/13C标记并测量了Trosy Trosy Trosy Triple resonance spectrum。对主链的信号分析和使用diorite方法对分子形态的观察将来将在未来进行。

项目成果

異方性核スピン相互作用を利用する新規NMR技術による超高分子量タンパク質の分子形態観測

使用利用各向异性核自旋相互作用的新 NMR 技术观察超高分子量蛋白质的分子形态

• 发表时间: 2008
• 作者: T.Matsuo;K.Onai;K.Okamoto;J.Minagawa;M.Ishiura;井上和秀;楯真一
• 通讯作者: 楯真一

大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素のループ部欠失変異体の構造安定性と機能

大肠杆菌二氢叶酸还原酶环缺失突变体的结构稳定性和功能

• 发表时间: 2007
• 作者: Matsuyama;M.;et al.;楯 真一
• 通讯作者: 楯 真一

he molecular morphology analysis using the orientation induced Trosy shiftchanges

使用定向诱导 Trosy 位移变化进行分子形态分析

• 发表时间: 2008
• 作者: 丸山大輔;遠藤斗志也;西川周一;楯真一
• 通讯作者: 楯真一

タンパク質の動的構造解析のための多周波数・高感度・高磁場NMR利用

使用多频、高灵敏度、高场 NMR 进行蛋白质动态结构分析

• 发表时间: 2008
• 作者: A.Tomita;T.Sato;K.Ichiyanagi;S.Nozawa;F.Kawai;S.-Y.Park;T.Tsuduki;T.Yamato;S.Koshihara;S.Adachi;白木琢磨;矢野覚士;楯真一
• 通讯作者: 楯真一

分子配向依存的Trosyシフト変化を用いたNMRによる高分子量蛋白質の分子形態変化観測技術

利用分子方向依赖的 Trosy 位移变化来观察高分子量蛋白质的分子形态变化的 NMR 观察技术

• 发表时间: 2009
• 作者: 伊藤鉄也;白旗崇;宮本久一;御崎洋二;塩路悦朗;H. Tsukaya;楯真一
• 通讯作者: 楯真一