ポリグルタミンによるカスパーゼ8、3活性化と核内運搬、共凝集の分子機構

Caspase 8,3 激活、核转运和聚谷氨酰胺共聚集的分子机制

基本信息

批准号：
12031228
负责人：
桃井隆
金额：
$ 0.9万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

CAGトリプレットリピートの伸張を原因とするハンチントン舞踏病、DRPLAなどの神経変性疾患では核内でのポリグルタミンの蓄積が観察される。伸長したポリグルタミンを細胞に発現させると細胞質内、核周辺部、および核内にポリグルタミンの凝集が生じ、細胞死をひき起こすことから、ポリグルタミンの凝集と神経細胞死との関係が問題となっている。一方、カスパーゼは線虫から哺乳類まで保存されており、細胞死を実行する分子として、現在までに12種類知られている。カスパーゼはそのメンバーにより逐次プロセッシングされるカスパーゼカスケードより活性化され、最終的にカスパーゼ3が活性化され、細胞死が誘導されると考えられている。中でも、カスパーゼ8と9はカスパーゼ3の上流に位置し、蛋白相互作用によるオリゴメリゼーションにより活性化されることが知られている。最近、Yuanらのグループがポリグルタミンがカスパーゼ8と細胞質や核内で共凝集し、活性化し、細胞死を引き起すことを報告している。われわれは、これまでカスパーゼ3と9の活性型のみを特異的に認識する抗体を作成し、細胞死におけるこれらカスパーゼの活性化を免疫染色法により観察してきた。本研究ではカスパーゼ3、8、9およびICADが伸長ポリグルタミンによりどこでどのように活性化されるかを調べる目的で、新たにカスパーゼ8の活性型を特異的に認識する抗体およびICADの切断点に対する抗体を作成し、細胞内での活性化と細胞死との関係をEGFPを付加したポリグルタミンと抗体あるいはTUNELとの二重染色法により解析した。(結果)P19EC細胞ではポリグルタミンの核内凝集が高頻度でおこり、TUNEL陽性および形態的なアポトーシス像を誘導した。ポリグルタミンの核内凝集と一致してカスパーゼ3、8の活性型の凝集が観察されたが、カスパーゼ9の活性化および活性型断片の凝集は観察されなかった。また、ICAD切断陽性の細胞も観察されるが、カスパーゼ阻害剤であるz-VADにより著しく抑制された。しかし、クロマチン凝集などのアポトーシス像は部分的にしか抑制されなかった。以上の事から核内ポリグルタミン凝集によるカスパーゼ3、8の活性化はICADおよびDNA断片化に必要であるが、形態的な細胞死にはカスパーゼ以外の経路が考えられた。

在亨廷顿舞蹈病和 DRPLA 等神经退行性疾病中观察到核聚谷氨酰胺积累，这些疾病是由 CAG 三联体重复扩增引起的。当延长的聚谷氨酰胺在细胞中表达时，聚谷氨酰胺在细胞质、核周区域和细胞核中发生聚集，导致细胞死亡。聚谷氨酰胺聚集与神经元细胞死亡之间的关系因此成为一个问题。另一方面，从线虫到哺乳动物，半胱天冬酶都是保守的，迄今为止，已知有 12 种半胱天冬酶作为执行细胞死亡的分子。据认为，caspase由caspase级联激活，caspase级联由其成员依次加工，最终激活caspase 3并诱导细胞死亡。其中，caspase 8和9位于caspase 3的上游，已知通过蛋白质相互作用引起的寡聚化而被激活。最近，Yuan等人的研究小组报道，聚谷氨酰胺与细胞质和细胞核中的caspase 8共聚，激活它，导致细胞死亡。我们之前已经创建了仅特异性识别半胱天冬酶 3 和 9 活性形式的抗体，并使用免疫染色方法观察了这些半胱天冬酶在细胞死亡过程中的激活。在本研究中，为了研究Caspase 3、8、9和ICAD在何处以及如何被扩增的聚谷氨酰胺激活，我们开发了一种特异性识别Caspase 8活性形式的新抗体和针对ICAD裂解点的新抗体。我们创建了一种抗体，并通过使用添加 EGFP 的聚谷氨酰胺和抗体或 TUNEL 进行双染色来分析细胞内激活和细胞死亡之间的关系。【结果】P19EC细胞中多聚谷氨酰胺的核聚集频繁发生，导致TUNEL阳性和形态学凋亡。与聚谷氨酰胺的核内聚集一致，观察到半胱天冬酶3和8的活性形式的聚集，但未观察到半胱天冬酶9的激活和活性片段的聚集。还观察到 ICAD 裂解阳性细胞，但它们被 caspase 抑制剂 z-VAD 显着抑制。然而，染色质聚集等细胞凋亡特征仅被部分抑制。上述结果表明，核内聚谷氨酰胺聚集激活caspases 3和8对于ICAD和DNA片段化是必要的，但caspases以外的途径可能是形态学细胞死亡的原因。