糸状菌の先端生長などに関与すると考えられる新たな生物分子モーターの機能解析

一种被认为参与丝状真菌尖端生长的新型生物分子马达的功能分析

• 批准号: 12030206
• 负责人: 堀内 裕之
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12030206/
• 关键词: キチン合成酵素; ミオシン; Aspergillus; キチン合成酵素; ミオシン; Aspergillus

CsmAはキチン合成酵素のN末端側にミオシンと相同性のあるドメインを持つ特異な構造をしたタンパク質で1852アミノ酸よりなり、我々のグループが糸状菌Aspergillus nidulansより初めてその遺伝子を単離した。その後、稲のいもち病菌であるPyricularia oryzae、大麦のうどん粉病菌であるBlumeria graminisからもそのホモログの単離が報告された。またごく最近公表された糸状菌Neurospora crassaの全ゲノム配列内にもCsmAのホモログをコードすると考えられる遺伝子が存在したが、酵母Saccharomyce cerevisiaeの染色体上にはこの遺伝子のホモログは存在しない。これらのことからCsmAは糸状菌において普遍的に存在するが、酵母型の生育をする生物には必要のないタンパク質である可能性がありその機能は非常に興味深い。本研究においてはまず、CsmAが実際にその全長を有するタンパク質としてA.nidulans内に存在することを確認するため、染色体上のCsmAをコードする領域のC末端に9XのHAのタグを挿入した株を作製した。この株と野生株について膜画分を調製しHAに対する抗体を用いてwestern解析を行ったところ、HAのタグを繋いだCsmAを発現させた株についてのみ約220kdのサイズにバンドが検出された。よって、CsmAが実際に菌糸内でぞの全長を持つタンパク質として存在していることが証明された。さらにCsmAのミオシン様ドメイン内のミオシンタンパク質によく保存された領域であるP-loop、Switch I内の保存されたアミノ酸それぞれ1つを置換したものを高発現する2種の株を作製した。これらの株において野生型のCsmAの代わりに1アミノ酸置換した変異型ミオシンを高発現させた場合どちらも野生株と同様の表現型を示した。このことからCsmAの活性にミオシンのモーター活性は必須ではないことが示唆された。一方、CsmAのミオシン様ドメインの機能についてin vitroで解析するため、この部分をGFPと連結したタンパクをS.cerevisiaeで大量発現させることを検討したが、目的の融合タンパクを大量に得ることができなかった。現在、in vitro transcription/translationの系で生産したCsmAのモータードメインとGFPとの融合タンパク質の精製を試みている。

CSMA是一种具有独特结构的蛋白质，其结构域与肌球蛋白同源于几丁质合酶的N末端，由1,852个氨基酸组成，我们的组首次通过丝状真菌曲霉曲霉曲霉尼古拉（Nidulans）首次分离了基因。后来，据报道，该同源物是从大米的虫斑，大米中的爆炸细菌和大麦的白粉病细菌的Blumeria graminis中报道的。在最近发表的丝状真菌神经孢子虫的整个基因组序列中，也有一个基因编码CSMA的同源物，但在酵母糖含量酿酒酵母的染色体上没有这种基因的同源物。从这些原因来看，CSMA普遍存在于丝状真菌中，但其功能非常有趣，因为它可能是一种蛋白质，对于以酵母形式生长的生物不是必需的蛋白质。在这项研究中，我们首先创建了一个菌株，其中将9倍公顷的标签插入了染色体上CSMA编码区的C末端，以确认CSMA实际上存在于A.Nidulans内，是其全长的蛋白质。为这种菌株和野生应变制备了膜级分，并使用HA抗体进行了西方分析，并以大约220 kD的范围检测到条带，仅用于表达用HA标记的CSMA的菌株。因此，已经证明，CSMA实际上是作为菌丝体内总长度的蛋白质存在的。此外，制备了两种菌株，这些菌株高度表达了在P环和开关I中代替一个保守的氨基酸，它们是CSMA的肌球蛋白样结构域中肌球蛋白蛋白中良好保守的区域。在这些菌株中，当将突变体肌球蛋白用一个氨基酸取代的高表达被取代为野生型CSMA时，两者都显示出与野生型相似的表型。这表明肌球蛋白运动活动对于CSMA活性不是必不可少的。另一方面，为了分析体外CSMA的肌球蛋白样结构域的功能，我们研究了在酿酒酵母中与GFP相关的蛋白质的大表达，但是我们无法获得大量所需的融合蛋白。目前，我们正在尝试在体外转录/翻译系统中产生的CSMA和GFP的运动结构域之间纯化融合蛋白。