糸状菌分泌酵素遺伝子を利用した酵母分泌系の解析

利用丝状真菌分泌酶基因分析酵母分泌系统

基本信息

批准号：
02660109
负责人：
堀内裕之
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02660109/
关键词：
糸状菌 Rhizopus 分泌 Saccharomyces cerevisiae aspartic proteinase

项目摘要

糸状菌Rhizopus niveusの菌体外アスパルティックプロテイナ-ゼI(RNAPーI)遺伝子をSaccharomyces cerevisiaeに導入すると効率よく菌体外に分泌されるが、このプロ配列中に変異を導入した改変遺伝子をS.cerevisiaeに導入したところ全く分泌されなくなった。そこで本研究ではこのような改変RNAPーI遺伝子を導入したS.cerevisiaeに対し各種の変異原で変異をかけ、改変RNAPーI遺伝子産物を菌体外に分泌するようになる変異株を取得し解析することを目的とした。変異株はカゼインを含む培地上でハロ-を形成するようになるものを選択した。まず変異原としてUVを用い約3800株のコロニ-に対してカゼイン培地上でのハロ-形成を検討したところこのうち121株がハロ-形成を行なった。これらの変異株のうちその変異が染色体上に由来するものを選択するために、形成されたハロ-が比較的大きい70株についてRNAPーI遺伝子を含むプラスミドのキュアリングを行なった。その結果、プラスミドのキュアリングによりハロ-形成をしなくなった株が37株存在した。そこでこれら変異株に再度改変RNAPーI遺伝子を導入し、カゼイン培地上でハロ-形成能を獲得した株については変異が染色体上に由来する可能性が強いと考えさらに解析を進めた。このような株は9株存在し菌体外へのRNAPーIの分泌量について培養上清の酵素活性測定、SDSーPAGEなどにより解析を行なった結果、分泌量が比較的多くSDSーPAGE上で成熟型RNAPーIと同じ位置にバンドが見られる変異株が1株得られている。変異原としてEMSを用いたものについても約4000株についてハロ-形成を検討したところ138株の変異株が得られた。このうち16株についてプラスミドのキュアリングと再形質転換を行ない、染色体上に変異が導入されていると思われるもの1株を得ている。現在、新たな変異株の取得を続行すると共にこれまでに得られた変異株の解析をさらに進めている。

当丝状真菌雪根霉的胞外天冬氨酸蛋白酶I(RNAP-I)基因被引入酿酒酵母时，它被有效地分泌到真菌外，而当被引入酿酒酵母时，没有发生分泌。因此，在本研究中，我们使用各种诱变剂对导入了这种修饰的RNAP-I基因的酿酒酵母进行突变，以获得将修饰的RNAP-I基因产物分泌到细菌体外的突变株，目的是进行分析。。选择在含有酪蛋白的培养基上形成光环的突变菌株。首先，我们使用紫外线作为诱变剂，研究了酪蛋白培养基上约 3,800 个菌落的光晕形成情况，发现其中 121 个菌落形成了光晕。为了在这些突变菌株中选择那些突变源自染色体的菌株，对70个具有较大晕圈的菌株进行了含有RNAP-I基因的质粒修复。结果，有37株菌株因质粒固化而不再形成光环。因此，我们将修饰后的RNAP-I基因重新引入这些突变菌株中，并进一步分析了在酪蛋白培养基上获得形成光环能力的菌株，认为突变很可能起源于染色体。这样的菌株有9个，通过测定培养上清液的酶活性和SDS-PAGE来分析细菌细胞外分泌的RNAP-I的量，获得了在与上述菌株相同的位置观察到条带的突变菌株。成熟的RNAP-I。当EMS用作诱变剂时，在大约4,000个菌株中研究了晕圈形成，并获得了138个突变菌株。我们对其中 16 个菌株进行了质粒修复和再转化，获得了一个在其染色体上似乎引入了突变的菌株。目前，我们正在继续获取新的突变菌株，并对目前获得的突变菌株进行进一步分析。