糸状菌の先端生長などに関与すると考えられる新たな生物分子モーターの解析

分析被认为与丝状真菌尖端生长有关的新型生物分子马达

基本信息

批准号：
11156206
负责人：
堀内裕之
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156206/
关键词：
Aspergillus キチン合成酵素ミオシン菌糸内菌糸

项目摘要

糸状菌Aspergillus nidulansのcsmAはキチン合成酵素のN末端側にミオシンモーター様のドメインを持つタンパク質をコードする遺伝子でありこの破壊株は菌糸の途中が膨らむ構造と菌糸内菌糸を生じること、この表現型はキチン合成酵素ドメインのみを発現させただけでは回復できないことをこれまでに明らかにした。今回はこのCsmAタンパクの細胞内での局在と動きを検討するため染色体上のcsmA locusでCsmAのORFのC末端にGFPが繋がる形のタンパクを発現できる株を作製したが、菌糸中にGFPのシグナルを検出することはできなかった。この遺伝子のプロモーターを強力なものに変えた株では顕微鏡下で菌糸内全体にドット状の蛍光が見られたが、この株の菌体抽出液に対する抗GFP抗体を用いたウェスタン解析では予想される220kd程度の位置にバンドを検出することはできなかった。そこでCsmAのN末端側にGFPが繋がる形のタンパクを発現できる株を作製しプロモーターを強力なものにしたところ、菌糸内全体にドット状の蛍光が見られたがやはり菌体抽出液に対するウェスタン解析では220kdの位置に安定してシグナルを検出するには至らなかった。またCsmAのミオシン様ドメインの機能をin vitroで解析するためこの部分とGFP連結したタンパク質をin vitroの転写・翻訳系により作製を行い抗GFP抗体を用いたウェスタン解析を行ったところこの融合タンパクが効率良く合成されていることが明らかとなった。

我们以前曾透露，在丝状真菌曲霉中的CSMA是一种基因，在几壳蛋白合酶的N-末端编码具有肌球蛋白运动型结构域的蛋白质，并且这种干扰菌株会产生杂化的结构，并产生一种杂种迈塞尔的结构，并且不能通过这种苯有管来重新构成CHITINT，即在CHIT型中进行表现。在本文中，我们创建了一种能够表达与CSMA ORF的C末端一起在染色体上与CSMA基因座连接的蛋白质的菌株，但我们无法检测到菌丝体中的GFP信号。在具有强启动子的菌株中，在显微镜下在整个菌丝体中观察到了点状荧光，但是使用抗GFP抗体对该菌株的细胞提取物进行的西方分析并未在约220 kD的位置检测带，这是预期的。因此，产生了能够表达与CSMA N末端连接的蛋白质并使启动子变得强大的菌株，并且在整个菌丝体中都观察到了点状荧光，但是细胞提取物的西方分析不允许在220 kd的位置稳定地检测信号。此外，为了在体外分析CSMA的肌球蛋白样结构域的功能，使用体外转录和翻译系统制备了与该部分和GFP相关的蛋白质，并且使用抗GFP抗体进行了西方分析，从而表明该融合蛋白有效地合成了这种融合蛋白。