糸状菌の先端生長などに関与すると考えられる新たな生物分子モーターの解析

分析被认为与丝状真菌尖端生长有关的新型生物分子马达

基本信息

批准号：
11156206
负责人：
堀内裕之
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156206/
关键词：
Aspergillus キチン合成酵素ミオシン菌糸内菌糸

项目摘要

糸状菌Aspergillus nidulansのcsmAはキチン合成酵素のN末端側にミオシンモーター様のドメインを持つタンパク質をコードする遺伝子でありこの破壊株は菌糸の途中が膨らむ構造と菌糸内菌糸を生じること、この表現型はキチン合成酵素ドメインのみを発現させただけでは回復できないことをこれまでに明らかにした。今回はこのCsmAタンパクの細胞内での局在と動きを検討するため染色体上のcsmA locusでCsmAのORFのC末端にGFPが繋がる形のタンパクを発現できる株を作製したが、菌糸中にGFPのシグナルを検出することはできなかった。この遺伝子のプロモーターを強力なものに変えた株では顕微鏡下で菌糸内全体にドット状の蛍光が見られたが、この株の菌体抽出液に対する抗GFP抗体を用いたウェスタン解析では予想される220kd程度の位置にバンドを検出することはできなかった。そこでCsmAのN末端側にGFPが繋がる形のタンパクを発現できる株を作製しプロモーターを強力なものにしたところ、菌糸内全体にドット状の蛍光が見られたがやはり菌体抽出液に対するウェスタン解析では220kdの位置に安定してシグナルを検出するには至らなかった。またCsmAのミオシン様ドメインの機能をin vitroで解析するためこの部分とGFP連結したタンパク質をin vitroの転写・翻訳系により作製を行い抗GFP抗体を用いたウェスタン解析を行ったところこの融合タンパクが効率良く合成されていることが明らかとなった。

丝状真菌构巢曲霉的 csmA 是一种编码蛋白质的基因，该蛋白质在几丁质合酶的 N 端侧具有肌球蛋白运动样结构域，这种破坏的菌株产生一种结构，其中菌丝中部膨胀，并且菌丝内部膨胀。菌丝，并且这种表型之前已经表明仅表达几丁质合酶结构域不能恢复这种状况。这次，为了检查这种CsmA蛋白的细胞内定位和运动，我们创建了一种菌株，该菌株可以表达一种蛋白，其中GFP与染色体上csmA基因座的CsmA ORF的C末端连接，但GFP未出现在菌丝中，检测不到信号。在该基因的启动子被改为更强的启动子的菌株中，在显微镜下可以在整个菌丝中看到点状荧光，但是使用抗 GFP 抗体对该菌株的细菌细胞提取物进行蛋白质印迹分析表明，预计在 220kd 左右的位置检测不到条带。因此，当我们创建了一种能够表达带有与 CsmA N 末端连接的 GFP 的蛋白质并使启动子更强的菌株时，在整个菌丝中观察到了点状荧光，但也对细菌细胞提取物进行了 Western 分析。，无法在220kd位置稳定地检测到信号。此外，为了在体外分析CsmA的肌球蛋白样结构域的功能，我们使用体外转录/翻译系统创建了与该区域和GFP连接的蛋白质，并使用抗GFP抗体进行了Western分析。很明显，合成是有效的。