糸状菌の極性的細胞壁合成メカニズムの解明

阐明丝状真菌极性细胞壁合成机制

基本信息

批准号：
04J11092
负责人：
竹下典男
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J11092/
关键词：
キチン合成酵素ミオシン Aspergillus nidulans 先端生長隔壁極性 CsmA CsmB アクチン Aspergillus

项目摘要

糸状菌の先端生長には、細胞壁キチンの極性的な合成が必須であり、アクチン細胞骨格は菌糸の極性を決定するうえで重要な役割を担っている。Aspergillus nidulansには、N末端側にミオシンと相同性があるドメイン(ミオシン様ドメイン)を持つキチン合成酵素をコードするcsmA、csmBの二種類の遺伝子が存在する。このタイプのキチン合成酵素のオルソログは、糸状菌または菌糸状に生育する菌からのみ単離されており、酵母には存在しないことから、これらが菌糸型の形態形成に特有の機能を持つことが予想される。これまでに、csmA産物(CsmA)が菌糸先端や隔壁形成部位のアクチン近傍に局在化し、その正常な局在化と機能にはミオシン様ドメインとアクチンとの結合が重要であることを示唆した。そして、csmB破壊株がcsmA破壊株と類似の表現型を示すこと、csmAとcsmBの二重破壊が合成致死性を示すことを明らかにした。そこで、csmBが破壊され、csmAの発現が制御可能な株を作製した。この株をcsmAの発現を抑制する条件で生育させたところ、著しい生育の遅れが見られ、単独破壊株で見られる表現型の他に先端生長に重篤な異常が見られた。今年度、csmAとcsmBの機能的相関関係をタンパク質レベルで更に解析を進めた。CsmBの機能をタンパク質レベルで検討するため、そのC末端に3コピーのFLAGタグが付加されほぼ正常な機能を有するCsmB-FLAGを野生型CsmB代わりに発現する株を作製した。そして、CsmB-FLAGが菌糸先端と隔壁形成部位においてアクチン近傍に局在化することを示し、CsmA-HAとも近接した領域に局在化することを示した。更に、CsmBのミオシン様ドメインとF-アクチンとの結合をin vitroで示した。これらのことから、CsmBもCsmAと同様にミオシン様ドメインとアクチンの結合を介して局在化し極性的な細胞壁合成に関わること、csmAとcsmBの条件的二重変異株の表現型を考え合わせると、その両者の菌糸先端における機能が正常な先端生長に必須であることが推定された。

细胞壁几丁质的极性合成对于丝状真菌尖端的生长至关重要，而肌动蛋白细胞骨架在决定菌丝极性方面起着重要作用。构巢曲霉有两个基因：csmA 和 csmB，它们编码几丁质合酶，在 N 端侧具有与肌球蛋白同源的结构域（肌球蛋白样结构域）。这种几丁质合酶的直系同源物仅从丝状或菌丝生长的真菌中分离出来，并且在酵母中不存在，这表明它们具有预期的菌丝形态发生特有的功能。我们之前已经表明，csmA 产物（CsmA）位于菌丝尖端和隔膜形成位点的肌动蛋白附近，肌球蛋白样结构域和肌动蛋白之间的结合对其正常定位和功能很重要。我们还发现csmB破坏的菌株表现出与csmA破坏的菌株相似的表型，并且csmA和csmB的双重破坏具有综合致死性。因此，我们创建了一种csmB被破坏并且csmA表达可以被控制的菌株。当该菌株在抑制 csmA 表达的条件下生长时，观察到显着的生长延迟，并且除了在单个破坏菌株中观察到的表型外，还观察到尖端生长的严重异常。今年，我们进一步从蛋白质水平分析了csmA和csmB之间的功能关系。为了在蛋白质水平上研究CsmB的功能，我们创建了表达CsmB-FLAG的菌株，其C末端添加了三个FLAG标签拷贝，并且具有几乎正常的功能，而不是野生型CsmB。我们还表明，CsmB-FLAG 定位于菌丝尖端和隔膜形成位点的肌动蛋白附近，并且也定位于靠近 CsmA-HA 的区域。此外，我们在体外证明了 CsmB 的肌球蛋白样结构域与 F-肌动蛋白之间的结合。考虑到这些发现，我们认为，与 CsmA 一样，CsmB 通过肌球蛋白样结构域和肌动蛋白的结合进行定位，并参与极性细胞壁的合成，并且考虑到 csmA 和 csmB 条件双突变体的表型，推测这两种功能都具有功能。菌丝尖端的部分对于正常尖端生长至关重要。