糸状菌の極性的細胞壁合成メカニズムの解明

阐明丝状真菌极性细胞壁合成机制

基本信息

批准号：
04J11092
负责人：
竹下典男
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J11092/
关键词：
キチン合成酵素ミオシン Aspergillus nidulans 先端生長隔壁極性 CsmA CsmB アクチン Aspergillus

项目摘要

糸状菌の先端生長には、細胞壁キチンの極性的な合成が必須であり、アクチン細胞骨格は菌糸の極性を決定するうえで重要な役割を担っている。Aspergillus nidulansには、N末端側にミオシンと相同性があるドメイン(ミオシン様ドメイン)を持つキチン合成酵素をコードするcsmA、csmBの二種類の遺伝子が存在する。このタイプのキチン合成酵素のオルソログは、糸状菌または菌糸状に生育する菌からのみ単離されており、酵母には存在しないことから、これらが菌糸型の形態形成に特有の機能を持つことが予想される。これまでに、csmA産物(CsmA)が菌糸先端や隔壁形成部位のアクチン近傍に局在化し、その正常な局在化と機能にはミオシン様ドメインとアクチンとの結合が重要であることを示唆した。そして、csmB破壊株がcsmA破壊株と類似の表現型を示すこと、csmAとcsmBの二重破壊が合成致死性を示すことを明らかにした。そこで、csmBが破壊され、csmAの発現が制御可能な株を作製した。この株をcsmAの発現を抑制する条件で生育させたところ、著しい生育の遅れが見られ、単独破壊株で見られる表現型の他に先端生長に重篤な異常が見られた。今年度、csmAとcsmBの機能的相関関係をタンパク質レベルで更に解析を進めた。CsmBの機能をタンパク質レベルで検討するため、そのC末端に3コピーのFLAGタグが付加されほぼ正常な機能を有するCsmB-FLAGを野生型CsmB代わりに発現する株を作製した。そして、CsmB-FLAGが菌糸先端と隔壁形成部位においてアクチン近傍に局在化することを示し、CsmA-HAとも近接した領域に局在化することを示した。更に、CsmBのミオシン様ドメインとF-アクチンとの結合をin vitroで示した。これらのことから、CsmBもCsmAと同様にミオシン様ドメインとアクチンの結合を介して局在化し極性的な細胞壁合成に関わること、csmAとcsmBの条件的二重変異株の表現型を考え合わせると、その両者の菌糸先端における機能が正常な先端生長に必須であることが推定された。

细胞壁几丁质的极性合成对于丝状真菌的尖端生长至关重要，肌动蛋白细胞骨架在确定菌丝体的极性中起着重要作用。曲霉尼杜族具有两种类型的基因：CSMA和CSMB，它们编码具有域（肌球蛋白样结构域）的几丁质合成酶，它们在N末端与肌球蛋白是同源性的。这种类型的几丁质合酶的直系同源物仅从丝状或系统发育细菌中分离出来，并且在酵母中不存在，因此有望具有菌丝形态发生特有的功能。迄今为止，CSMA产物（CSMA）在菌丝尖端和隔膜地层位点附近局部局部定位，这表明肌球蛋白样结构域与肌动蛋白的结合对于它们的正常定位和功能很重要。然后发现CSMB破坏菌株表现出与CSMA破坏菌株相似的表型，并且CSMA和CSMB的双重破坏表现出合成的致死性。因此，CSMB被破坏，并产生能够控制CSMA表达的菌株。当这种菌株在抑制CSMA表达的条件下生长时，它显示出显着的生长延迟，除了在单层破坏性菌株中看到的表型外，还观察到顶端生长的严重异常。今年，在蛋白质水平上对CSMA和CSMB之间的功能相关性进行了进一步分析。为了研究CSMB在蛋白质水平上的功能，我们创建了一种表达CSMB-FLAG（几乎正常功能）的菌株，代替了野生型CSMB，并在其C-terminus上附有了三个FLAG标签的副本。结果表明，CSMB-FLAG位于菌丝尖端和隔膜地层位置附近的肌动蛋白附近，并将其定位于接近CSMA-HA的区域。此外，在体外显示了CSMB肌球蛋白样结构域与F-肌动蛋白的结合。从这些发现（例如CSMA）中，CSMB通过肌球蛋白样结构域和肌动蛋白的结合定位，并参与极性细胞壁的合成，并考虑了CSMA和CSMB的条件双突变菌株的表型，估计估计这两种功能对正常的基质生长至关重要。