mRNAキャッピングシステムの機能

mRNA加帽系统的功能

• 批准号: 12029220
• 负责人: 水本 清久
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12029220/
• 关键词: キャップ構造; RNAポリメラーゼII; キャッピング酵素遺伝子; Xenopus laevis; Cryza sativa; センダイウイルス; 転写開始複合体; RNAウイルス転写キャッピング

真核細胞およびそのウイルスの遺伝子発現で重要な役割を演じているmRNA5′-キャップ構造の生合成機構について,酵素化学的並びに分子遺伝学的解析を行った.1.細胞のキャッピングシステム:Xenopus laevisよりmRNAキャッピング酵素遺伝子(xCAP1a,xCAP1b)ならびにmRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素遺伝子(xCMT1)を単離し,その構造と酵素活性について検討した.xCAP1aタンパク質は,ヒトをはじめとするキャッピング酵素と高度に類似したアミノ酸配列を持ち,N末端側にRNA5′-トリホスファターゼドメイン,C末端側にグアニル酸転移酵素ドメインを有するbifunctional enzymeであった.また,これまで明らかでなかった植物の遺伝子としてrice mRNAキャッピング酵素遺伝子(OsCAP1)を単離することに成功した.OsCAP1は,ヒトをはじめとする動物型酵素に分類され,1本のポリペプチド鎖上に上記と同様の2つの酵素活性ドメインを有していた.OsCAP1の持つRNA5′-トリホスファターゼ活性は,RNA5′末端のγ位リン酸を特異的に水解し,モノヌクレオチドには作用しないという特徴を有していた.酵母キャッピング酵素βサブユニット遺伝子(CET1)の温度感受性変異体(ts変異体)を7種類分離した.このうちの一部は,RNA5′-トリホスファターゼ活性に必要な部位にアミノ酸変異が入っっておりin vitroにおいて酵素活性はts性を示した.また一部(G527D,S419L,T396I)は,in vitroでの酵素活性には影響ないが,細胞は温度感受性を示した.このことは,これらのアミノ酸が,RNAトリホスファターゼ活性以外のCet1の必須機能に関与することを示している.RNAポリメラーゼII(polII)転写開始複合体を活性状態で分離し,その中にキャッピング酵素およびmRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素が特異的に組み込よれていること,またキャッピング酵素はCTDがリン酸化されたpolII(polIIo)に特異的に結合することを免疫化学的,酵素化学的に示した.2.ウイルスの転写-キャッピングシステム:センダイウイルスのin vitro mRNA合成は,ほぼ完全に宿主因子の存在に依存する.宿主因子を高度に精製し,それが少なくと4種類の因子からなることを明らかにした.この内の2つについて,チューブリンおよび解糖系酵素のホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)であることを同定した,チューブリンの作用の一つとして,ウイルスMタンパク質をウイルスRNPから除去することにより転写開始を活性化する事を見いだした.さらに,ウイルスRNP中にキャップメチル化酵素が存在することを酵素化学的に明らかにした.

酶促化学和分子遗传分析是在mRNA5'-CAP结构的生物合成机制上进行的，MRNA5'-CAP结构在真核细胞及其病毒中起着重要作用。1。细胞盖系统：从Xenopus laevis中分离出mRNA限制酶基因（XCAP1A，XCAP1B）和mRNA（鸟嘌呤-7-）甲基转移酶基因（XCMT1），并检查了其结构和酶活性。 XCAP1A蛋白是一种具有氨基酸序列的双功能酶，与N-Terminus的RNA5'-三磷酸酶结构域（包括人类）高度相似，在N末端和C-ensinus处的RNA5'-三磷酸酶结构域和一个鸟苷酸转移酶结构蛋白。此外，大米是植物中以前未知的基因。我们成功地分离了mRNA限制酶基因（OSCAP1）。 OSCAP1被归类为包括人类在内的动物型酶，并具有与上述一个多肽链上上面提到的两个酶活性域相似。 OSCAP1的RNA5'-三磷酸酶活性的特征是在5'-末端RNA上特异性水解磷酸磷酸盐，而不是作用于单核苷酸。酵母上限酶β亚基基因（CET1）的七个温度敏感突变体（TS突变体）。其中一些包含RNA5'-三磷酸酶活性所需的位点的氨基酸突变，并且酶活性在体外是TS样的。此外，尽管它对体外的酶活性没有影响，但某些（G527D，S419L，T396i）仍在其中，但细胞对温度敏感。这表明这些氨基酸与RNA三磷酸酶活性以外的CET1的基本功能有关。 RNA聚合酶II（POLII）转录起始复合物在活性状态下分离，并将限制酶和mRNA（鸟嘌呤7-）甲基转移酶特异性地整合到其中，并在其上进行了限量，并在酶上表明CTD与磷酸化的poliio（polosphorated poliiio（Polosp.polosp.））。 2。病毒转录限制系统：体外仙台病毒。 mRNA合成几乎完全取决于宿主因子的存在。宿主因素被高度纯化，并揭示了至少四种因素。其中两个被确定为微管蛋白和糖酵解酶磷酸甘油酸激酶（PGK），发现微管蛋白的一种作用通过从病毒RNP中去除病毒M蛋白来激活转录起始。此外，病毒RNP中的帽甲基酶的存在被酶促揭示。

项目成果

E.Kajita et al.: "Isolation and characterization of Xenopus laevis aldolase B cDNA and expression patterns of aldolase A, B, and C genes in adult tissues, oocytes and embryos of Xenopus laevis."Biochemica et Biophysica Acta. 1493. 101-118 (2000)

E. Kajita 等人：“非洲爪蟾醛缩酶 B cDNA 的分离和表征，以及非洲爪蟾成体组织、卵母细胞和胚胎中醛缩酶 A、B 和 C 基因的表达模式。”生物化学与生物物理学学报。

J.Yokoska et al.: "Cloning and characterization of mRNA capping enzyme and mRNA (guanine-7-)-methyltransferase cDNAs from Xenopus laevis."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 268. 617-624 (2000)

J.Yokoska 等人：“来自非洲爪蟾的 mRNA 加帽酶和 mRNA (鸟嘌呤-7-)-甲基转移酶 cDNA 的克隆和表征。”Biochem.Biophys.Res.Comm.. 268. 617-624 (2000)