RNAポリメラーゼIIによる転写開始の酵素機構

RNA聚合酶II转录起始的酶促机制

基本信息

批准号：
63620502
负责人：
水本清久
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

RNAポリメラーゼII(polII)による転写反応において、「RNA5'末端のキャツピング」と「ATP水解の要求性」の2点は他のRNAポリメラーゼ種と異なる大きな特徴であり、いいれも転写開始反応と密接に関連している。本研究ではこれらの特徴に着目し、polIIによる転写の初期反応を解析すると共に、キャッピング酵素の構造と機能について検討し、以下の結果を得た。(1)転写開始複合体形成とキャッピング酵素-Ad2後期主要プロモーターおよびAd12pIXプロモーターをモデル鋳型とし、HeLa細胞抽出液を用いたin vitro転写系統を利用しpolII転写開始複合体形成反応を解析した。グリセロール密度勾配遠心により50-60Sの開始複合体を分離し、この複合体中にキヤップ構造の形成に関する酵素系のうち、いわゆるキャッピング酵素(RNA5'-トリホスファターゼ活性+RNAグアニル酸転移酵素活性)ならびにmRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素が特異的に組み込まれていることを明らかにした。しかも、複合体中のこれらキャッピング関連酵素は、転写と共役した時にのみ機能し、キャップ形成をなし得ることが判明した。(2)ATP水解の要求性-上記転写開始複合体の形成にはATP(あるいは3'dATP、2'dATP)のβ-γ位ピロリン酸結合の水解が必要であり、AMPPNPは不活性であった。ATP非存在下にも約50Sの前開始複合体が形成されるが、活性ある開始複合体に転換されるためには、開始因子の一部とATP水解が必要であった。(3)キャッピング酵素遺伝子の構造と機能-λgt11をベクターとする酵母染色体遺伝子ライブラリーより、酵母キャッピング酵素(グアニル酸転移酵素サブユニット)遺伝子を単離した。遺伝子破壞の実験から、この遺伝子は酵母の生育に必須であることが判明した。さらに、種々の欠失変異体を作成し、キャッピング酵母の機能ドメインの解析を開始した。

在与RNA聚合酶II（polii）的转录反应中，有两个主要特征：“在RNA5'End the RNA5'End”和“ ATP水解需求”是与其他RNA聚合酶种类不同的独特特征，它们都与转录起始反应密切相关。在这项研究中，我们专注于这些特征，分析了polii转录的初始反应，并检查了封盖酶的结构和功能，并获得了以下结果。（1）转录起始复合物的形成和限制酶-AD2后期主要启动子和AD12PIX启动子作为模型模板，以及使用HELA细胞提取物的体外转录菌株用于分析polii转录起始启动复合复杂形成反应。通过甘油密度梯度离心分离了50-60S的起始复合物，并且发现在与结构结构形成的酶系统中，所谓的封闭酶（RNA5'-TRIPH磷酸酶活性（RNA-Triph磷酸酶活性）（RNA-triphospase Ettivation + RNA圭烷酸盐转移酶的活性）和Guanyine（Guany-7-7-7-7-7-7-7-7-7-7-7-7-7-7-）是甲基转移。此外，发现与转录结合并可以形成CAP时，仅在复合函数中的这些与上限相关的酶。（2）对ATP水解的需求 - 上述转录起始复合物的形成需要对ATP（或3'DATP，2'DATP）和AMPPNP的β -γ焦磷酸键进行水解。在没有ATP的情况下，形成了约50 s的预原始复合物，但是某些起始因子和ATP水解需要转换为活跃的起始复合物。（3）使用λgt11作为载体，从酵母染色体基因文库中分离出封封酶基因的结构和功能 - 酵母上限酶（鸟苷酸转移酶亚基）基因。基因分解实验表明，该基因对于酵母生长至关重要。此外，创建了各种缺失突变体，并开始对上限酵母的功能域进行分析。