mRNAキャッピング酵素分子とその遺伝子の構造と機能

mRNA加帽酶分子及其基因的结构和功能

基本信息

批准号：
61230005
负责人：
水本清久
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

mRNAキャッピング酵素はmRNAグアニル酸転移酵素活性とRNA5'ートリホスファターゼ活性から構成されている。動物細胞からの酵素は単一ポリペプチド鎖からなるのに対して、酵母のキャッピング酵素はサブユニット構造を有する。キャッピング酵素の構造と機能をさらに解明するために、本年度の研究実施計画に基いて研究を行い、以下の成果を得た。(1)Artemia salina(brine shrimp)の胚よりキャッピング酵素を均一標品となる迄精製し、そのドメイン構造を解析した。精製酵素(73KDa)はトリプシンによる限定分解で44KDaのグアニル酸転移酵素ドメインと32KDaのトリホスファターゼドメインにそれぞれ活性をもった状態で分離された。両ドメインとも基質特異性やRNA鎮認識能においてインタクトな酵素と大きな差違は認められず、それぞれがかなり独立したドメイン構造を形成していると推定された。(2)酵母よりキャッピング酵素を高度に、かつ大量に精製する方法を確立した。精製酵素は80KDaと52KDaのサブユニットから成り、SDS-ゲル電気泳動後のin situ アッセイによって前者がトリホスファターゼ,後者がグアニル酸転移酵素活性を有する事を証明した。(3)酵母の精製酵素でモルモットを免疫し、同酵素に対する抗体を得た。本抗体は酵母の酵素に特異的であり、ラット肝,A.salina,ワクシニアウイルスからのキャッピング酵素とは反応しなかった。又、Western blot法からこの抗体は酵母酵素の両サブユニットを認識した。(4)λgt11を発現ベクターとする酵母遺伝子ライブラリーを上記抗体を用いてスクリーニングし、グアニル酸転移酵素遺伝子を含むクローンを分離した。このクローンは約3.5Kbの酵母遺伝子を含み、目下、その構造を解析している。(5)in vitro転写系を用いてRNAポリメラーゼ【II】による転写開始反応を解析した。キャッピング酵素が転写開始複合体中に特異的に含まれることを見出した。

mRNA限制酶由mRNA鸟烯酸酯转移酶活性和RNA5'-胞磷酸酶活性组成。来自动物细胞的酶由单个多肽链组成，而酵母上限酶具有亚基结构。为了进一步阐明上限酶的结构和功能，根据今年的研究实施计划进行了研究，并获得了以下结果。（1）将封盖酶从Artemia salina（盐水虾）的胚胎纯化为均匀的制剂，并分析了域结构。纯化的酶（73KDA）通过胰蛋白酶通过有限的降解分离，其活性在44KDA的鸟甘酸转移酶结构域和32KDA的三磷酸酶结构域分别分离。在底物特异性或RNA抗识别能力方面，这两个域与完整酶没有显着差异，并且据估计，每个域都形成了相当独立的域结构。（2）已经建立了一种方法来净化酵母中高和大量的封盖酶。纯化的酶由80 kDa和52 kDa亚基组成，SDS-凝胶电泳后的原位测定表明前者具有三磷酸酶，后者具有鸟苷酸转移酶的活性。（3）用纯化的酵母酶对豚鼠进行免疫，以获得针对酶的抗体。该抗体是特异性的，是酵母酶的特异性，不与大鼠肝脏，萨利纳链球菌，牛acinia病毒的封盖酶反应。此外，这种抗体从蛋白质印迹法识别酵母酶的两个亚基。（4）使用上述抗体筛选了具有λgt11作为表达载体的酵母基因文库，并分离了含有鸟苷酸转移酶基因的克隆。该克隆含有大约3.5 kb的酵母基因，目前正在分析其结构。（5）使用体外转录系统分析了RNA聚合酶[II]的转录起始反应。已经发现，封盖酶特异性包含在转录起始复合物中。