構造及び機能単位としてのモジュールを組み合わせた新規蛋白質の分子設計と創製

将模块作为结构和功能单元的新型蛋白质的分子设计和创造

基本信息

批准号：
12002008
负责人：
森島績
金额：
$ 250.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.モジュール間相互作用の再生を目指した方法論の開発ヘモグロビンα鎖のヘム結合モジュールをシトクロムb_5の対応する領域に導入したb_5αb_5を作製し、ランダム変異導入後、ヘム親和性を指標に構造力安定化している蛋白質のスクリーニングを行ったところ、ヘム結合モジュールに近接する特定の部位に変異が集中していた。そこで、構造上の歪みがかかっていると考えられるこれら残基に範囲をしぼってランダム変異を導入した変異体集団を作製し、さらに、スクリーニング過程に、崩れた構造の変異蛋白質を蛋白質分解酵素により除去するプロセスを新たに加え方法論の改良を行ったところ、モジュール置換蛋白質の安定性の向上に成功した。2.新規機能性蛋白質の創製に成功ヒトのトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)と相互作用する蛋白質を探索したところ、解糖系の酵素であるグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GapDH)がTrpRSと結合することが明らかになった。TrpRSと結合するGapDHの結合部位の特定を試みるために、様々なキメラ蛋白質を作製した。ミオグロビン(Mb)のN末端側にGapDHのあるモジュールを融合したキメラ蛋白質は、野生型Mb同様、酸素を可逆的に配位でき、またGAPDH同様にTrpRSと会合する安定な新規蛋白質であることが明らかになった。3.酸化ストレス応答性新規グロビン蛋白質の分子機構の解明とその知見に基づく人工蛋白質の設計「ニューログロビン(Ngb)」には酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きがあると指摘されている。今回、このNgbが脳神経系においてシグナル伝達系を制御する分子として機能しているという仮説を立て、Ngbが関与する脳神経シグナル伝達系を明らかにすることを目指した。その結果、酸化ストレス下で生成する鉄3価Ngbが細胞内シグナル伝達蛋白質であるGαと特異的に結合すること、他方、通常の酸素正常状態の鉄2価NgbはGαとは相互作用しないことを発見した。また、Ngbは酸化ストレス応答性のセンサー蛋白質として働き、酸化ストレスを受けた時のみGαと結合し、GαのGDP/GTP交換反応抑制蛋白質として機能することにより、神経細胞死を抑制することを明らかにした。さらに、Ngbに関しモジュール置換した種々のキメラ蛋白質を作製し、それらの解析を行うことにより、制御メカニズムを分子レベルで明らかにすることに成功した。

1. 开发旨在再生模块间相互作用的方法我们通过将血红蛋白α链的血红素结合模块引入到细胞色素b_5的相应区域中，创建了b_5αb_5，并在引入随机突变后，以血红素亲和力为指标稳定了结构当我们筛选突变的蛋白质时，我们发现突变集中在靠近血红素结合模块的特定位点。因此，我们通过在这些被认为具有结构扭曲的残基中引入随机突变来创建突变体群体，然后在筛选过程中使用蛋白水解酶来提取具有扭曲结构的突变蛋白，通过添加新的去除过程并改进方法。，他们成功地提高了模块替换蛋白的稳定性。 2. 成功创造出一种新型功能蛋白在寻找与人色氨酸tRNA合成酶（TrpRS）相互作用的蛋白时，我们发现糖酵解酶甘油醛3-磷酸脱氢酶（GapDH）与TrpRS相互作用，这一点变得很清楚。已连接。为了鉴定 GapDH 与 TrpRS 结合的结合位点，我们创建了各种嵌合蛋白。肌红蛋白（Mb）的N末端融合了带有GapDH的模块的嵌合蛋白可以像野生型Mb一样可逆地协调氧，并且与GAPDH一样，它是一种与TrpRS结合的稳定的新蛋白。。 3. 阐明新型氧化应激反应性球蛋白的分子机制并基于此知识设计人工蛋白神经球蛋白（Ngb）已被指出具有抑制与氧化应激相关的神经元细胞死亡的能力。这次，我们假设Ngb作为控制脑神经系统信号转导系统的分子发挥作用，旨在阐明Ngb参与的脑神经信号转导系统。结果，我们发现氧化应激下产生的三价铁 Ngb 特异性结合细胞内信号蛋白 Gα，而正常含氧量条件下的二价铁 Ngb 不与 Gα 相互作用。此外，还发现Ngb作为氧化应激反应性传感器蛋白，仅在受到氧化应激时与Gα结合，并通过作为Gα GDP/GTP交换反应抑制蛋白发挥作用来抑制神经元细胞死亡。此外，通过创建各种Ngb模块被替换的嵌合蛋白并对其进行分析，我们成功地阐明了分子水平的调控机制。