構造及び機能単位としてのモジュールを組み合わせた新規蛋白質の分子設計と創製

将模块作为结构和功能单元的新型蛋白质的分子设计和创造

基本信息

批准号：
12002008
负责人：
森島績
金额：
$ 250.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.モジュール間相互作用の再生を目指した方法論の開発ヘモグロビンα鎖のヘム結合モジュールをシトクロムb_5の対応する領域に導入したb_5αb_5を作製し、ランダム変異導入後、ヘム親和性を指標に構造力安定化している蛋白質のスクリーニングを行ったところ、ヘム結合モジュールに近接する特定の部位に変異が集中していた。そこで、構造上の歪みがかかっていると考えられるこれら残基に範囲をしぼってランダム変異を導入した変異体集団を作製し、さらに、スクリーニング過程に、崩れた構造の変異蛋白質を蛋白質分解酵素により除去するプロセスを新たに加え方法論の改良を行ったところ、モジュール置換蛋白質の安定性の向上に成功した。2.新規機能性蛋白質の創製に成功ヒトのトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)と相互作用する蛋白質を探索したところ、解糖系の酵素であるグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GapDH)がTrpRSと結合することが明らかになった。TrpRSと結合するGapDHの結合部位の特定を試みるために、様々なキメラ蛋白質を作製した。ミオグロビン(Mb)のN末端側にGapDHのあるモジュールを融合したキメラ蛋白質は、野生型Mb同様、酸素を可逆的に配位でき、またGAPDH同様にTrpRSと会合する安定な新規蛋白質であることが明らかになった。3.酸化ストレス応答性新規グロビン蛋白質の分子機構の解明とその知見に基づく人工蛋白質の設計「ニューログロビン(Ngb)」には酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きがあると指摘されている。今回、このNgbが脳神経系においてシグナル伝達系を制御する分子として機能しているという仮説を立て、Ngbが関与する脳神経シグナル伝達系を明らかにすることを目指した。その結果、酸化ストレス下で生成する鉄3価Ngbが細胞内シグナル伝達蛋白質であるGαと特異的に結合すること、他方、通常の酸素正常状態の鉄2価NgbはGαとは相互作用しないことを発見した。また、Ngbは酸化ストレス応答性のセンサー蛋白質として働き、酸化ストレスを受けた時のみGαと結合し、GαのGDP/GTP交換反応抑制蛋白質として機能することにより、神経細胞死を抑制することを明らかにした。さらに、Ngbに関しモジュール置換した種々のキメラ蛋白質を作製し、それらの解析を行うことにより、制御メカニズムを分子レベルで明らかにすることに成功した。

1。产生了旨在重新再生相互作用B_5αB_5的方法的发展，其中将血红蛋白α链的血红素结合模块引入到了细胞色素B_5的相应区域中，并在引入了筛选的蛋白质中，将其定位为蛋白质，并将其定位为固定属性，并将其定位为固定型，并将其定为固定属性。血红素结合模块。因此，通过限制这些残基的范围来创建一个已引入随机突变的突变体的群体，这些残基被认为在结构上是扭曲，此外，在筛选过程中，添加了一个新的过程来消除使用蛋白水解酶破碎的结构的突变蛋白，并且该方法的方法是不受欢迎的蛋白质蛋白质的稳定性。 2。当我们搜索与人类色氨酸TRNA合酶（TRPRS）相互作用的蛋白质时，成功创建了一种新型的功能蛋白，揭示了3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），一种糖酵解酶，与TRPRS结合。生成了各种嵌合蛋白，以尝试鉴定与TRPR结合的GAPDH的结合位点。据透露，在肌红蛋白（MB）的N末端与GAPDH融合的嵌合蛋白可以像野生型MB一样可逆地协调氧，并且是一种稳定的新型蛋白质，与TRPR相关联，类似于GAPDH。 3。基于发现的新型球蛋白蛋白的分子机制以及基于发现的人造蛋白质的设计，“神经蛋白（NGB）”已指出，其功能是抑制与氧化应激相关的神经元细胞死亡的功能。现在，我们假设NGB充当调节颅神经系统中信号系统的分子，并旨在阐明涉及NGB的颅神经信号传导系统。结果，我们发现在氧化应激下产生的铁三价NGB特异性结合了Gα（一种细胞内信号传导蛋白），而另一方面，在正常氧状态下铁型NGB不与Gα相互作用。还表明，NGB充当对氧化应激有反应的传感器蛋白，并且仅在受到氧化应激时才与Gα结合，并且起作用的蛋白质，可抑制GDP/GTP换反应的蛋白，从而抑制神经元细胞死亡。此外，通过创建用于NGB的模块替代的各种嵌合蛋白并分析它们，我们成功地发现了分子水平的调节机制。