金属酵素の不安定中間体を観測するための高速溶液混合実験システムの開発

金属酶不稳定中间体高速溶液混合实验系统的研制

基本信息

批准号：
11554027
负责人：
森島績
金额：
$ 9.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

平成12年度はペルオキシターゼの活性中間体であるCompound Iの生成機構を検討するため,独自に開発した高速混合装置を用いて,西洋ワサビペルオキシターゼ(HRP)と過酸化水素との反応を追跡した。装置としては,本研究者らが開発した高速混合装置を改良することにより,時間分解能50マイクロ秒で可視紫外吸収スペクトルことに成功した。この装置を用いて,上記反応を追跡したところ,HRPの休止状態からCompound Iへのスペクトル変化が,ほぼ等吸収点をとりながら観測できた。このことは休止状態からCompound Iの変化において中間体が存在しないことを意味しているが,過酸化水素の濃度に対するCompound I生成速度の依存性は,速度論的な中間体が存在する明らかに飽和現象を示し,Michaelis-Menten型の解析をすることで,その寿命(半減期)が約10μ秒であることが明らかとなった。さらにこの値をもとに,このような寿命を持つ中間体を仮定したモデルを考え,反応後50マイクロ秒後の中間体の存在割合を求めたところ,約15%と見積もられ,その推定される紫外可視スペクトルは休止状態に類似した鉄3価高スピン型であった。このことは,Compound I生成の中間体として,従来想定されていた3価のヘム鉄にアニオン化した過酸化水素(HOO^-)が結合した鉄3価低スピン型ではなく,中性の過酸化水素(HOOH)が結合した状態であると推定できた。このような中間体を形成する反応機構として,中性の過酸化水素がヘム鉄に結合できるように,ヘム近傍の遠位ヒスチジンと遠位アルギニンが同時に過酸化水素と相互作用しているモデルを新たに提出した。

2000年，为了研究过氧化物酶活性中间体Compound I的形成机制，我们利用自主研发的高速混合装置跟踪了辣根过氧化物酶（HRP）与过氧化氢之间的反应。通过改进目前研究人员开发的高速混合装置，我们成功获得了时间分辨率为50微秒的可见光和紫外吸收光谱。当使用该装置进行上述反应时，可以观察到从HRP的静止状态到化合物I的光谱变化几乎具有等吸光点。虽然这意味着化合物I从静止状态的变化中不存在中间体，但是化合物I形成速率对过氧化氢浓度的依赖性清楚地表明存在动力学中间体，其表现出饱和现象，并且米氏-。 Menten型分析显示其寿命（半衰期）约为10微秒。此外，基于这个值，我们考虑了一个假设中间体具有这样的寿命的模型，并计算了反应后 50 微秒存在的中间体的比例，估计约为 15% 所得的紫外-可见光谱是三价铁的。高自旋型类似于静止状态。这表明用于化合物I生产的中间体不是如先前假设的其中阴离子过氧化氢(HOO^-)与三价血红素铁键合的低自旋三价铁类型，而是中性的过氧化铁氢。氧化物（HOOH）与其结合。作为形成这种中间体的反应机制，我们提出了一种模型，其中靠近血红素的远端组氨酸和远端精氨酸同时与过氧化氢相互作用，使得中性过氧化氢可以与血红素铁结合。