金属酵素の不安定中間体を観測するための高速溶液混合実験システムの開発

金属酶不稳定中间体高速溶液混合实验系统的研制

基本信息

批准号：
11554027
负责人：
森島績
金额：
$ 9.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

平成12年度はペルオキシターゼの活性中間体であるCompound Iの生成機構を検討するため,独自に開発した高速混合装置を用いて,西洋ワサビペルオキシターゼ(HRP)と過酸化水素との反応を追跡した。装置としては,本研究者らが開発した高速混合装置を改良することにより,時間分解能50マイクロ秒で可視紫外吸収スペクトルことに成功した。この装置を用いて,上記反応を追跡したところ,HRPの休止状態からCompound Iへのスペクトル変化が,ほぼ等吸収点をとりながら観測できた。このことは休止状態からCompound Iの変化において中間体が存在しないことを意味しているが,過酸化水素の濃度に対するCompound I生成速度の依存性は,速度論的な中間体が存在する明らかに飽和現象を示し,Michaelis-Menten型の解析をすることで,その寿命(半減期)が約10μ秒であることが明らかとなった。さらにこの値をもとに,このような寿命を持つ中間体を仮定したモデルを考え,反応後50マイクロ秒後の中間体の存在割合を求めたところ,約15%と見積もられ,その推定される紫外可視スペクトルは休止状態に類似した鉄3価高スピン型であった。このことは,Compound I生成の中間体として,従来想定されていた3価のヘム鉄にアニオン化した過酸化水素(HOO^-)が結合した鉄3価低スピン型ではなく,中性の過酸化水素(HOOH)が結合した状態であると推定できた。このような中間体を形成する反応機構として,中性の過酸化水素がヘム鉄に結合できるように,ヘム近傍の遠位ヒスチジンと遠位アルギニンが同時に過酸化水素と相互作用しているモデルを新たに提出した。

在2000年，为了研究化合物I的形成机理，一种过氧化物酶的活性中间体，我们使用了专有的高速混合装置来跟踪辣根过氧化物酶（HRP）与过氧化氢的反应。作为一种设备，通过改善研究人员开发的高速混合装置，我们成功地实现了可见的紫外吸收光谱，其时间分辨率为50微秒。使用此设备，跟踪上述反应，并在几乎同时使用等轴刺激点时观察到了从HRP静止状态到化合物的光谱变化。这意味着，化合物I与静息状态的变化没有中间体，但是化合物I产生速率对过氧化氢的浓度的依赖性显示出存在的清晰的饱和现象，其中存在中间体，并且通过分析Michaelis-Menteren类型，发现其寿命（半寿命）约为10μ。此外，基于此值，我们考虑了一个模型，该模型假设一个具有这种寿命的中间体，并在反应后计算了中间体50微秒的存在比，并且估计它约为15％，并且估计的紫外线可见光谱是类似于休息状态的高型型铁型。可以估计，作为化合物I形成的中间体，不是铁三价低旋转类型的过氧化氢（Hoo^ - ）与以前已经设想的三价血红素铁的约束，而是中性氢（hooh）的状态。作为形成此类中间体的一种反应机制，我们提出了一种新模型，在该模型中，远端组氨酸和精氨酸在血红素附近的远端精氨酸同时与过氧化氢相互作用，以便中性氢过氧化氢可以与血红素铁结合。