人工神経回路を用いた小脳シナプス淘汰の研究

利用人工神经回路进行小脑突触选择的研究

基本信息

批准号：
11878162
负责人：
狩野方伸
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では培養系において単離小脳プルキンエ細胞に対するシナプス形成過程のリアルタイム分析を目指している。第1段階として、マウス・プルキンエ細胞の単離培養系の開発を行い、さらに培養プルキンエ細胞の発達過程を分析した。小脳ニューロンに最適化した無血清培地(Furuya et al.,1998)を用い、さらに播種密度などの諸条件を系統的に検討した結果、従来難しかったマウス胎児由来単離小脳プルキンエ細胞の長期(1ヶ月以上)培養が可能となった。また、この方法により培養したプルキンエ細胞では樹状突起形態や電気的興奮特性の発達が生体内での生後発達と良く似た時間推移で進行し、所期の実験遂行に適当であることが分かった。第2段階として、上記の培養系に下オリーブ核ニューロンをの共培養する技術を開発した。2〜3日前に準備しておいた小脳ニューロン培養系の上に妊娠16日齢マウス胎児由来の下オリーブ核スライスを貼付することにより、登上線維を数百ミクロンにわたって出芽・伸展させることに成功した。また共培養開始直前にgene gunを用いて蛍光色素DiIを付着させた金属微粒子を下オリーブ・スライスに打ち込む技術も開発した。この技術により、生きたままの状態で登上線維を効率良く標識できるようになった。さらにDiI標識像をレーザー共焦点顕微鏡で5〜10分毎に観察することにより、登上線維の伸展の様子を24時間以上にわたりリアルタイムで観察することに成功した。現在、第3段階として、GFP遺伝子を導入し自家蛍光を発するようにしたプルキンエ細胞を単離培養系の材料として用い、DiI標識登上線維のGFP標識プルキンエ細胞に対する神経支配過程のリアルタイム分析を進めている。なお、培養法に関する成果はJournal of Neuroscience Methods (Tabata et al.,104:45-53,2000)に発表した。また、培養法の応用に関する論文をProc.Natl.Acad.Sci.USA.(Furuya et al.,97:11528-11533,2000)に発表し、Journal of Neuroscienceにも投稿中である。

这项研究旨在对培养系统中孤立的小脑Purkinje细胞的突触形成过程进行实时分析。作为第一步，我们开发了一种用于小鼠浦肯野细胞的孤立培养系统，并进一步分析了培养的purkinje细胞的发育过程。使用针对小脑神经元优化的无血清培养基（Furuya等，1998），并系统地检查了各种条件，例如播种密度，可以从长期（超过1个月）中培养从小鼠胎儿中分离出的小脑Purkinje细胞。此外，发现使用这种方法培养的purkinje细胞具有类似于体内产后发育的时间的树突形态和电激发特征，并且适用于所需的实验。作为第二阶段，我们开发了一项技术，将较低橄榄核神经元共同培养为上述培养系统。通过将较低的橄榄核切片从16天大的怀孕小鼠胎儿施加到2-3天前制备的小脑神经元培养系统上，我们成功地萌芽并将攀岩纤维扩展到数百微米以上。我们还开发了一项技术，其中在共培养开始之前，使用基因枪植入了带有荧光染料DII的细金属颗粒。这项技术允许在活着的状态下有效地攀登纤维。此外，通过观察每5-10分钟用激光共聚焦显微镜观察DII标记的图像，我们成功地观察到攀岩纤维实时延伸24小时以上。当前，作为第三步，已引入以产生自动荧光的浦肯野细胞被用作孤立培养系统的材料，并对针对GFP标记的Purkinje细胞的DII标记的攀岩纤维的神经化过程进行了实时分析。有关培养方法的结果列于《神经科学方法》杂志（Tabata等，104：45-53,2000）。他还发表了一篇有关培养方法在Proc的应用的论文。纳特。学院。科学。美国（Furuya等，97：11528-11533，2000），目前正在《神经科学杂志》中提交。