発達期中枢神経系シナプスの選択的強化・除去過程のリアルタイムイメージング

发育中的中枢神经系统突触选择性强化和去除过程的实时成像

基本信息

批准号：
21650094
负责人：
狩野方伸
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21650094/
关键词：
ニューロンシナプス神経回路蛍光タンパク質

项目摘要

本研究では、登上線維-プルキンエ細胞シナプスの選択的強化・除去がどのように進行するのかを直接解明することを目指し、新たなリアルタイムイメージング方法を開発する。昨年度、延髄細胞の軸索やプルキンエ細胞を蛍光タンパクの発現により可視化する方法を最適化した。また、3種類の蛍光シグナルを検出できるようにレーザーなど顕微鏡の改良を行った。本年度は、(1)3種類の蛍光タンパク質(BFP,GFP,Tomato)の組み合わせ発現により、細胞や線維を多くの別々の色で、生きたまま染色する方法を確立した。さらに、(2)それらの生きた細胞、線維を長期的に観察できる実験系の確立を目指し、標本を浸す液やその液に送る気体などに関して、条件検討を行った結果、顕微鏡下で、温度とpHを制御した状態で、細胞や線維を1日以上経時的に観察できるシステムを開発した。このように、複数の生きた細胞や線維を同時にかつ区別して、1日以上リアルタイムで観察できる実験系がほぼ確立できた。残された課題は、蛍光タンパク質を任意の細胞に発現させる方法の開発である。プルキンエ細胞へは特異的なプロモーター(L7)を使用すれば可能だが、登上線維は適したプロモーターがない。新規プロモーターの探索あるいはプルキンエ細胞からシナプスを介して逆行的に遺伝子を登上線維に輸送する方法の開発を必要とする。このことが達成されれば、登上線維、プルキンエ細胞のリアルタイムイメージングを行うことができ、登上線維-プルキンエ細胞シナプスの選択的強化・除去の実体を解明することが可能となる。さらにこれらの方法は、脳内で起こる様々な現象に応用することが可能であり、多くの研究に貢献できることが期待される。

在本研究中，我们将开发一种新的实时成像方法，旨在直接阐明攀爬纤维浦肯野细胞突触的选择性强化和去除是如何进行的。去年，我们优化了一种通过表达荧光蛋白来可视化髓质细胞轴突和浦肯野细胞的方法。他们还改进了显微镜，包括激光器，使其能够检测三种类型的荧光信号。今年，我们建立了一种将活细胞和纤维染色成多种不同颜色的方法，方法是：（1）结合三种荧光蛋白（BFP、GFP和Tomato）的表达；此外，（2）我们的目标是建立一个能够长期观察这些活细胞和纤维的实验系统，并通过检查有关样品浸入其中的液体和输送到该液体的气体的条件，我们发现我们开发了一种系统，可以在受控 pH 条件下观察细胞和纤维一天或更长时间。就这样，我们几乎建立了一个实验系统，可以让我们同时区分多个活细胞和纤维，并实时观察它们一天多的时间。剩下的挑战是开发一种在任意细胞中表达荧光蛋白的方法。虽然浦肯野细胞可以使用特定的启动子（L7），但没有适合攀爬纤维的启动子。有必要寻找新的启动子或开发一种将基因从浦肯野细胞通过突触逆行转运至攀爬纤维的方法。如果实现了这一点，就可以对攀爬纤维和浦肯野细胞进行实时成像，并有可能阐明选择性强化和去除攀爬纤维-浦肯野细胞突触的实质。此外，这些方法可以应用于大脑中发生的各种现象，并有望为许多研究做出贡献。