活動性の高いニューロンへの光穿孔による選択的遺伝子導入

通过光穿孔选择性基因转移到高度活跃的神经元中

基本信息

批准号：
25640007
负责人：
狩野方伸
金额：
$ 2.5万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25640007/
关键词：
神経科学生理学脳・神経ニューロンシナプス

项目摘要

生きた動物個体の脳において、活動性の高い神経細胞に光を用いて自由に遺伝子導入できる技術を開発することが本研究の目的である。In vivoカルシウムイメージングによって同定された活動性の高いニューロンに、フェムト秒パルスレーザーを用いて細胞膜の光穿孔を行うことで、広い範囲（500ミクロン四方）に分布するニューロン一つ一つに独立に外来遺伝子を導入することを可能にする。これまでに、マウス個体脳において光穿孔を行うための条件検討を開始した。蛍光色素を脳内の細胞外領域に注入し、個々のニューロンの近傍で光照射を行い、細胞内に蛍光色素が取り込まれるかどうかで光穿孔を確認した。脳内の様々な深さにおいて、光穿孔に必要なレーザー強度、パルス幅、繰り返し頻度について検討を行った。皮質の表面近傍では光穿孔が可能であることは確認されたが、さらに深層のニューロンに光穿孔を行うための条件検討が必要であることが判明した。また、活動性の高いニューロンを同定するためのin vivoカルシウムイメージングの感度を向上させ、効率を高めるために、新規の高感度カルシウム感受性指示薬について、脳スライス標本およびマウス生体内でその特性を検討した。その結果、マウス生体内においても１発の活動電位で起こるカルシウム濃度変化を高いS/N比で検出するできることが確認された。さらに、活動性の高い神経細胞の活動を長期にわたって観察し、かつ、光による活動操作を行うために必要なカルシウムセンサータンパク質やチャネルロドプシンなどの分子を、光穿孔によって導入するためのプラスミドを作製した。

这项研究的目的是开发一种技术，允许利用光将基因自由地引入活体动物大脑中高度活跃的神经元中。通过使用飞秒脉冲激光对通过体内钙成像识别的高度活跃神经元的细胞膜进行光学穿孔，可以独立处理分布在大面积（500微米见方）上的每个神经元，从而能够引入基因。到目前为止，我们已经开始研究在个体小鼠大脑中进行光学穿孔的条件。将荧光染料注射到大脑的细胞外区域，用光照射各个神经元附近，通过荧光染料是否进入细胞来确认光穿孔。我们研究了在大脑不同深度进行光学穿孔所需的激光强度、脉冲宽度和重复频率。虽然证实在皮层表面附近可以进行光学穿孔，但发现需要考虑对更深层神经元进行光学穿孔的条件。此外，为了提高体内钙成像识别高度活跃神经元的灵敏度和效率，我们研究了一种新型高灵敏度钙敏感指示剂在脑切片制剂和体内小鼠中的特性。结果证实，即使在小鼠体内，也可以以高信噪比检测由单一动作电位引起的钙浓度变化。此外，我们创建了一个质粒来引入钙传感器蛋白和视紫红质等分子，这些分子对于长期观察高度活跃的神经元的活动以及通过光穿孔操纵其活动是必需的。