赤血球産生を制御するシグナル伝達分子の探索と機能解析

控制红细胞生成的信号分子的搜索和功能分析

基本信息

批准号：
11878142
负责人：
吉村昭彦
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878142/
关键词：
チロシンキナーゼ JAK STAT エリスロポエチンノックアウトマウス c-kit SH2 PH

项目摘要

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明かとなった。また最も高い発現はCD34low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分画に得られた。現在生化学的な解析を行っている。次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明かにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウアトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

为了阐明红细胞生成的机制，我们分析了在造血干细胞中特异性表达的基因。首先，使用细胞分类器将造血干细胞分离，并通过PCR扩增从该细胞种群创建cDNA文库。将其纳入酵母两杂化的载体中，并用C-Kit作为诱饵进行筛选。结果，克隆了一个称为Stap-1的新基因。该基因是通过c-kit磷酸化的酪氨酸，该基因磷酸化，带有pleckstrin同源（pH）结构域和SRC同源性2（SH2）域的衔接子分子。 RT-PCR表明，STAP-1表达仅限于携带C-KIT的骨髓细胞。在CD34LOW/-SCA-1+C-KIT+LIN-的干细胞分数中也获得了最高表达。目前正在进行生化分析。接下来，我们对CIS3进行了功能分析，我们将其克隆为一个分子，该分子调节了来自促红细胞生成素受体的信号。在胎儿肝脏的成红细胞祖细胞中，顺式3表达。创建敲除小鼠以揭示其生理功能。顺式3 - / - 敲除胎儿致死，在受精后12天之前，野生型的形态没有显着差异，但是在第12.5-15天，在胚胎中观察到整体身体出血。另外，肝脏的结构特别破坏，并充满了核胎胎红细胞。在存在EPO的情况下，培养胎儿肝细胞比野生型小鼠大得多的BFU-E（预言性红细胞祖细胞）菌落。此外，在红细胞祖细胞中证实了顺式和JAK2的关联。因此，证明CIS3是对胎儿造血干细胞中EPO/JAK2信号负调控的一个因素。