赤血球産生を制御するシグナル伝達分子の探索と機能解析

控制红细胞生成的信号分子的搜索和功能分析

基本信息

批准号：
11878142
负责人：
吉村昭彦
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878142/
关键词：
チロシンキナーゼ JAK STAT エリスロポエチンノックアウトマウス c-kit SH2 PH

项目摘要

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明かとなった。また最も高い発現はCD34low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分画に得られた。現在生化学的な解析を行っている。次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明かにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウアトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

为了阐明红细胞生成的控制机制，我们分析了造血干细胞中特异性表达的基因。首先，使用细胞分选仪从骨髓细胞中分离出造血干细胞，并通过 PCR 扩增从该细胞群中创建 cDNA 文库。将其整合到酵母双杂交载体中，并使用 c-kit 作为诱饵进行筛选。结果，他们克隆了一个名为 STAP-1 的新基因。该基因是含有 Pleckstrin 同源 (PH) 结构域和 Src 同源 2 (SH2) 结构域的接头分子，并被 c-kit 酪氨酸磷酸化。 RT-PCR结果显示STAP-1表达定位于含有c-kit的骨髓细胞。 CD34low/-Sca-1+c-kit+Lin-干细胞组分中获得最高表达。目前正在进行生化分析。接下来，我们对 CIS3 进行了功能分析，我们将其克隆为控制促红细胞生成素受体信号的分子。 CIS3 在胎儿肝脏的红系祖细胞中强烈表达。基因敲除小鼠的诞生是为了阐明其生理功能。 CIS3-/-敲除是胚胎致死的，虽然在受精后12天之前与野生型没有明显的形态差异，但在受精后12.5至15天胚胎中观察到全身出血。尤其是肝脏的结构已经塌陷，并且充满了有核的胎儿红细胞。当胎儿肝细胞在 EPO 存在下培养时，与野生型小鼠相比，形成了更大的 BFU-E（原红细胞祖细胞）集落。此外，在成红细胞祖细胞中证实了 CIS3 和 JAK2 之间的关联。因此，CIS3被证明是胎儿造血干细胞中EPO/JAK2信号的负调节因子。