高度好熱菌遺伝子操作のための薬剤耐性遺伝子の耐熱化

高温细菌基因工程的耐热耐药基因

基本信息

批准号：
11878118
负责人：
倉光成紀
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

高度好熱菌Thermus thermophilus HB8は,遺伝子操作系が確立した生物の中で最も高温で棲息可能な生物である。この高度好熱菌とランダム変異法とを利用して,カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Kan)をコードするカナマイシン薬剤耐性遺伝子を85℃まで耐熱化し,これまでで最も耐熱性の薬剤耐性遺伝子を作製することに作製に成功した。得られた耐熱性変異型酵素の中から約100個のクローンを選択して塩基配列を決定し,そらのアミノ酸配列を比較して,置換アミノ残基の中から耐熱化に寄与するいくつかのアミノ酸残基を同定した。耐熱化機構を調べるために,溶液中での蛋白質機能解析や分子動力学的計算を行ったところ,このKanの耐熱化は,分子の柔らかい部分を固くすることで達成されていることが示唆された。この耐熱性遺伝子を利用して,高度好熱菌の遺伝子破壊株を作製する簡便な方法を確立,アミノ酸代謝系やDNA修復系酵素群の遺伝子破壊株を作製した。それによって得られた遺伝子破壊株は,期待通りのアミノ酸代謝欠損やDNA修復能欠損の性質を示した。ここで確立した遺伝子破壊株作製法は,高度好熱菌T.thermophilus HB8の機能ゲノム科学的解析に威力を発揮し,得られた遺伝子破壊株の情報は,蛋白質の系統的立体構造解析(構造ゲノム科学的解析)の情報とともに,機能未知の蛋白質の機能解析に大いに役立つと期待される。

Thermus Hyphilus HB8是通过基因工程系统建立的最高温度生物。使用这种高度嗜热细菌和随机突变方法，编码卡纳米霉素核苷酸转移酶（KAN）的卡纳米霉素耐药性基因耐热至85°C，并且已经成功产生了最耐热的耐药性耐药性基因。从获得的热耐药突变酶中选择了大约100个克隆以确定碱基序列，并比较了氨基酸的氨基酸序列，并在取代的氨基残基中鉴定出了有助于热抗热的氨基酸残基。为了研究耐热性的机制，在溶液中进行了蛋白质功能分析和分子动力学计算，并建议通过硬化分子的软部分来实现KAN的耐热性。使用这种耐热基因，建立了一种简单的方法来产生高度嗜热细菌的基因脱离菌株，并产生了基因 - 脱离的氨基酸代谢菌株和DNA修复酶。所得的基因破坏菌株表现出氨基酸代谢和DNA修复能力缺乏的预期特性。此处建立的基因破坏菌株产生方法在对高度嗜热细菌T.嗜热HB8的科学分析中有效，并且预计获得的基因破坏菌株的信息在对具有不知情功能的蛋白质的功能分析中非常有用，以及来自功能的蛋白质，以及来自系统基因结构分析（结构基因组科学分析）的信息。