2つの基質結合部位を持つ酵素の蛋白質工学的解析

具有两个底物结合位点的酶的蛋白质工程分析

基本信息

批准号：
08680684
负责人：
倉光成紀
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アミノ基転移酵素は2つのアミノ酸基質間のアミノ基転移反応を触媒する。大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT),芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素(AroAT),分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素(BCAT)などは,酸性基質に対する反応性は似かよっているが,疎水性基質に対する反応性は異なっている。蛋白質工学的解析より,これらの酵素は酸性基質用と疎水性基質用の2つの基質結合ポケットを持ち,基質によって2つのポケットを使い分けていることが明らかになった。このように2つの性質の異なる基質結合ポケットを使い分けるのは,アミノ基転移酵素のみならず,転移酵素一般に広く使われている酵素設計原理と考えられる。この「1酵素-2基質」酵素の分子設計原理を詳細に解析するために,立体構造および機能解析に適した高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のAspATの遺伝子をクローニングし,DNAの塩基配列を決定し,酵素量産化のためのプラスミドを構築した。精製して得られた高度好熱菌AspATは非常に安定で,pH7では90℃まで安定であり,25℃ではpH2-12の領域で安定であった。この高度好熱菌AspATの分子全体の揺らぎは,常温生物の酵素よりも少ないことが明らかになった。常温生物のAspAT同様,塩基性の酸性基質結合用ポケットに,酸性基質のCOO^-が酵素結合した。ところが意外なことに,疎水性アミノ酸基質認識部位は,常温生物の疎水性基質結合部位よりも揺らぎが大きく,疎水性基質に対する基質特異性が広いことが明らかになった。このような疎水性基質に対する高度好熱菌酵素の広い特異性は,高度好熱菌の遺伝子数が常温生物よりもはるかに少なく,数少ない種類の酵素で多くの種類のアミノ酸のアミノ基転移反応を触媒する必要があるためと考えられる。

转氨酸转移酶催化了两个氨基酸底物之间的透射转移反应。大肠杆菌天冬氨酸氨基转移酶（ASPAT），芳香族氨基转移酶（AROAT），分支链链氨基转移酶（BCAT）和其他对酸性底物的反应性相似，但对疏水性底物的反应性有所不同。蛋白质工程分析表明，这些酶具有两个底物结合口袋，一个用于酸性底物，另一种用于疏水底物，并且根据底物使用两个不同的口袋。认为具有不同特性的底物结合口袋的这种差异被认为是酶设计原理，不仅在氨基转移酶中，而且在一般使用转移酶中通常使用。为了详细分析该“ 1酶-2底物”酶的分子设计原理，对高度嗜热细菌的ASPAT基因therus thermus thermus hb8 hb8适用于三维和功能分析，并克隆了DNA序列，确定了DNA序列，并确定了质体的质量生产。通过纯化获得的高度嗜热细菌非常稳定，pH 7至90°C，在25°C下为2-12。已经表明，高度嗜热细菌的总体波动小于室温生物体中酶的整体波动。就像室温生物体中的Aspat一样，酸性底物coo^ - 酶上与基本的酸性底物结合袋结合。然而，令人惊讶的是，已经发现疏水性氨基酸底物识别位点比室温生物的疏水底物结合位点具有更大的波动，并且疏水性底物的底物特异性更广泛。高度嗜热酶对这种疏水性底物的广泛特异性被认为是因为高度嗜热细菌的基因数量远小于正常温度生物体中的基因数量，因此有必要催化多种类型的氨基酸类型的氨基酸反应的Transamino组反应，并具有几种类型的酶。