Identification and analysis of endogenous strong promoters in the extreme thermophile Thermus thermophilus using whole-genome shotgun approach.

使用全基因组鸟枪法鉴定和分析极端嗜热栖热菌的内源性强启动子。

基本信息

批准号：
21K05376
负责人：
平津圭一郎
金额：
$ 2.58万
依托单位：
防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度はThermus thermophilus HB27株のゲノムDNA断片をレポータープラスミドに挿入したショットガンライブラリーを10個用いてプロモータースクリーニング実験を行ったが、本年度はさらに10個のショットガンライブラリーのスクリーニングを行い、合計して571種類の高いプロモーター活性を示すクローンを単離した。ゲノム配列データを用いてこれらのDNA断片に含まれる推定遺伝子（ORF）を確認すると、55クローンは転写の対象となるORFが存在しない偽陽性であった。また、12クローンはCRISPR領域やtmRNAなど、プロモーター部位の推定が難しい機能性RNAを含むためにプロモーター配列の解析対象から除外した。その結果、残りの504クローンを分類すると、190クローンはそれぞれ異なるゲノム領域を含んでおり、残りの314クローンは複数が重複して111種類のORF上流領域を含んでいた。重複クローンは、1つのORFに対して異なる断片長のゲノムDNAがプロモーター活性を示すので、偽陽性の可能性が低い最も信頼性の高い陽性クローンと考えられた。これら111種類の重複したORF上流の塩基配列を対象にプロモーター配列の推定を行ったところ、110種類がσ70型のプロモーター認識共通配列全体（-35配列および-10配列）と類似した塩基配列を含んでいた。昨年度はORF上流の非コード領域を対象に58種類を解析し、σ70型認識共通配列全体と高い類似性を示す割合は約6割（34/58種類）であったが、今年度は非コード領域に限定せずにDNA配列解析を行った結果、ほぼすべてが共通配列全体と高い類似性を有していた。これらの推定プロモーター配列は、転写対象のORF内やその上流のORF内に位置する例が多数見つかっており、T. thermophilus の遺伝子構造の特異性を表している可能性が示唆された。

去年，我们使用10个shot弹枪文库进行了启动子筛选实验，其中将热嗜热菌株HB27的基因组DNA片段插入了报告基因质粒中。但是，今年我们筛选了10个shot弹枪库，总共隔离了571种表现出高启动子活性的克隆。使用基因组序列数据，这些DNA片段中包含的假定基因（ORF）表明55个克隆是假阳性，没有ORF为转录靶标。此外，从分析启动子序列的目标中排除了12个克隆，因为它们包含难以预测启动子位点的功能性RNA，例如CRISPR区域和TMRNA。结果，当对剩余的504个克隆进行分类时，190个克隆中的每个克隆都包含不同的基因组区域，其余314个克隆包含111个重叠区域的ORF区域。重叠的克隆被认为是最可靠的正阳性克隆，其误报概率最低，因为不同片段长度的基因组DNA表现出一个ONF的启动子活性。当启动子序列在这111种类型上游的111个重叠的ORF碱基序列上估算时，110种类型的核苷酸序列类似于整个σ70启动子识别公共序列（-35和-10序列）。去年，在ORF上游的非编码区域分析了58种类型，约60％（34/58类型）与整个σ70型共同序列显示出很高的相似性，但是今年，DNA序列分析是在没有限制非编码区域的，几乎与整个共同序列相似的情况下进行的。这些推定的启动子序列的许多例子都被发现位于ORF内的转录靶标和上游，这表明它们可能代表T. thermophilus遗传结构的特异性。