超機能性合成オリゴヌクレオチドによる特定遺伝子の転写制御法の開発

使用超功能合成寡核苷酸开发特定基因的转录控制方法

基本信息

批准号：
11877395
负责人：
今西武
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

一般に、三重鎖核酸の形成は標的二重鎖DNAがホモプリン-ホモピリミジン配列の場合に限定され、これがアンチジーン法の一般化・実用化を大きく妨げている.申請者らは、これまでにアンチジーン法によるDNAレベルでの遺伝子発現制御に向けた新しい核酸類縁体2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acid(2',4'-BNA)の合成に成功している。今回、このBNAの標的DNAに対する三重鎖形成能を詳細に評価したところ、BNAが極めて高い三重鎖形成能を有すること、その三重鎖形成は配列特異的であること等の興味深い知見が得られた。さらに、このBNAに新たな核酸塩基を導入し、これまでは極めて困難とされてきたCG塩基対をHoogsteen型水素結合にて認識可能かどうかという点について検討を進めた。合成した新規BNA類縁体については、各種スペクトル解析(NMR、X線結晶解析)によって、その糖部立体配座が厳密にN型に固定化されていることを確認した。さらに、これら新規BNA類はアミダイト化した後、DNA合成機を用いオリゴヌクレオチドへ導入した。新規BNAを含むオリゴヌクレオチド類について、その三重鎖形成能をTm測定により評価したところ、三重鎖形成が困難であるとされている中性条件下においても、CG塩基対を極めて効果的に認識し、安定な三重鎖核酸を形成し得ることを見出した。本結果は今後のアンチジーン法の開発研究にとって非常に重要な意味を持つものである。

通常，三链核酸的形成仅限于目标双链DNA是高嘌呤-高嘧啶序列的情况，这极大地阻碍了反基因方法的推广和实际应用。类似物，2'-O,4'-C-亚甲基桥核酸（2',4'-BNA），用于使用基因方法在 DNA 水平控制基因表达。在这项研究中，我们对BNA与靶DNA形成三链体的能力进行了详细的评估，并发现了有趣的发现，例如BNA具有极高的形成三链体的能力，并且三链体的形成具有序列特异性。此外，我们在该BNA中引入了新的核碱基，并研究了是否可以通过Hoogsteen型氢键识别CG碱基对，这迄今为止被认为是极其困难的。对于合成的新BNA类似物，我们通过各种光谱分析（NMR、X射线晶体学）证实糖部分的构象严格固定为N型。此外，这些新型 BNA 被转化为 amidites，然后使用 DNA 合成仪引入寡核苷酸。当通过 Tm 测量评估含有新型 BNA 的寡核苷酸形成三链体的能力时，即使在认为三链体形成困难的中性条件下，它们也能极其有效地识别 CG 碱基对，发现可以形成稳定的三链核酸。这一结果对于未来反基因方法的研究和发展具有非常重要的意义。