遺伝子ネットワーク解明に向けた高機能性人工デコイ核酸の開発

开发高功能人工诱饵核酸以阐明基因网络

• 批准号: 13202033
• 负责人: 今西 武
• 金额: $ 3.78万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13202033/
• 关键词: 核酸類縁体; オリゴヌクレオチド; デコイ核酸; BNA; 転写制御; 遺伝子発見制御; アポトーシス; 遺伝子ネットワーク

デコイ核酸は、転写因子などDNA結合タンパク質の認識配列に見せかけ、本来結合すべきDNAとの結合を阻害する。これらデコイ核酸を活用することにより、特定の転写因子によって支配されていた複数の遺伝子発現を一挙に制御することが可能となり、遺伝子ネットワークの解明に向けた新たな突破口となることが期待できる。我々はこれまでに糖部立体配座を固定した新規なヌクレオシド類縁体(BNA)の開発を行ってきた。本研究では。これらヌクレオシド類縁体を高機能性素子として用いたデコイ核酸を各種合成し、それらの機能評価を行ない、以下のような成果を得た。[1]BNAをNF-κBの認識配列中へ導入し、合計9種の人工デコイ核酸(BNA-decoy)を合成した。[2]ゲルシフト法を用い人工デコイ核酸とNF-κBの相互作用について検討した結果、PMAもしくはTNF-αにより刺激したHeLa細胞の核抽出物中のNF-κBと数種のBNA-decoyが効果的に結合することを見い出した。[3]HeLa細胞にレポータープラスミドと共にBNA-decoyを導入し、レポーター遺伝子の発現制御を試みたところ、PMAもしくはTNF-α刺激により上昇した転写活性をBNA-decoyにより抑制することに成功した。これら転写抑制活性と上記のゲルシフト法の結果の間には明らかな相関が見られた。[4]NF-κBがアポトーシスからの回避に関わっていることから、アポトーシス誘導時のHeLa細胞におけるNF-κBの活性をBNA-decoyにより抑えたところ、PMAもしくはTNF-α刺激によるアポトーシスの誘導をこれら人工デコイ分子が顕著に促進するという非常に興味深い知見を得た。S-オリゴにかわる人工核酸をデコイ分子として用い遺伝子発現制御を達成した例はこれまでほとんど知られておらず、今回の成果は世界的にも非常に意義深いものであると言える。

诱饵核酸将自身伪装成 DNA 结合蛋白（例如转录因子）的识别序列，并抑制它们与它们应该结合的 DNA 的结合。利用这些诱饵核酸，可以同时控制特定转录因子控制的多个基因的表达，这有望为阐明基因网络提供新的突破。迄今为止，我们已经开发出具有固定糖部分构象的新型核苷类似物（BNA）。在这项研究中。我们使用这些核苷类似物作为高功能元件合成了各种诱饵核酸并评估了它们的功能，并获得了以下结果。 [1] 通过将BNA引入NF-κB的识别序列中，总共合成了9种人工诱饵核酸（BNA-decoys）。 [2] 利用凝胶位移法检测人工诱饵核酸与 NF-κB 之间的相互作用，我们发现经 PMA 或 TNF-α 刺激的 HeLa 细胞核提取物中的 NF-κB 和几种类型的 BNA-decoy 是有效的发现它们可以相互结合。 [3] 当我们试图通过将 BNA-decoy 与报告质粒一起引入 HeLa 细胞来控制报告基因表达时，我们成功地抑制了 BNA-decoy 因 PMA 或 TNF-α 刺激而增加的转录活性。在这些转录抑制活性和上述凝胶迁移方法的结果之间发现了明显的相关性。 [4]由于NF-κB参与逃避细胞凋亡，我们用BNA-decoy抑制了HeLa细胞在细胞凋亡诱导过程中的NF-κB活性，这抑制了PMA或TNF-α刺激诱导的细胞凋亡的诱导。有趣的发现是这些人工诱饵分子显着促进了这一点。迄今为止，利用人工核酸作为诱饵分子代替S-oligos实现基因表达控制的已知例子还很少，这一结果可以说在世界范围内具有重要意义。

项目成果

Obika, S., Hari, Y., Sekiguchi, M., Imanishi, T.: "Eine 2´,4´-verbruckte Nucleinsaure mit 2-Pyridon als Nucleobase : effiziente Erkennung einer C・G-Unterbrechung durch Triplexbildung mit einem Pyrimidinmotiv"Angew.Chem.. 113・11. 2149-2151 (2001)

Obika, S.、Hari, Y.、Sekiguchi, M.、Imanishi, T.：“Angew.Chem.. 113・11. 2149-2151 (2001)

Nakamura, T., Hinagata, J., Tanaka, T., Imanishi, T., Wada, Y., Kodama, T., Doi, T.: "HSP90, HSP70, and GAPDH Directly Interact with the Cytoplasmic Domain of Macrophage Scavenger Receptors"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 290・2. 858-864 (2002)

Nakamura, T.、Hinagata, J.、Tanaka, T.、Imanishi, T.、Wada, Y.、Kodama, T.、Doi, T.：“HSP90、HSP70 和 GAPDH 直接与巨噬细胞的细胞质结构域相互作用清道夫受体”Biochem.Biophys.Res.Commun..290・2.858-864(2002)

Obika, S., Onoda, M., Morita, K., Andoh, J., Koizumi, M., Imanishi, T.: "3´-Amino-2´,4´-BNA : Novel Bridged Nucleic Acids Having an N3´->P5´ Phosohoramidate Linkage"Chem.Commun.. 19. 1992-1993 (2001)

Obika, S.、Onoda, M.、Morita, K.、Andoh, J.、Koizumi, M.、Imanishi, T.：“3´-Amino-2´,4´-BNA：新型桥接核酸，具有N3´->P5´ Phosohoramidate Linkage"Chem.Commun.19. 1992-1993 (2001)

Torigoe, H., Hari, Y., Sekiguchi, M., Obika, S., Imanishi, T.: "2´-O,4´-C-Methylene Bridged Nucleic Acid Modification Promotes Pyrimidine Motif Triplex DNA Formation at Physiological pH : Thermodynamic and Kinetic Studies"J.Biol.Chem.. 276・4. 2354-2360 (2

Torigoe, H.、Hari, Y.、Sekiguchi, M.、Obika, S.、Imanishi, T.：“2´-O,4´-C-亚甲基桥核酸修饰促进嘧啶基序三链体 DNA 在生理 pH 值下的形成：热力学和动力学研究“J.Biol.Chem.. 276・4. 2354-2360 (2

Obika, S., Uneda, T., Sugimoto, T., Nanbu, D., Minami, T., Doi, T., Imanishi, T.: "2´-O,4´-C-Methylene Bridged Nucleic Acid (2´,4´-BNA): Synthesis and Triplex-forming Properties"Bioorg.Med.Chem.. 9・4. 1001-1011 (2001)

Obika, S.、Uneda, T.、Sugimoto, T.、Nanbu, D.、Minami, T.、Doi, T.、Imanishi, T.：“2´-O,4´-C-亚甲基桥核酸(2´,4´-BNA)：合成和三链体形成性质“Bioorg.Med.Chem..9・4.1001-1011(2001)