カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化反応による脳由来神経栄養因子産生の調節機構

钙调蛋白依赖性蛋白磷酸化反应产生脑源性神经营养因子的调节机制

• 批准号: 11157226
• 负责人: 山本 秀幸
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11157226/
• 关键词: NG108-15細胞; カルシウム; カルモデュリン; カルモデュリンキナーゼII; 神経細胞死; 転写調節; 脳由来神経栄養因子(BDNF); プロモーター解析

脳由来神経栄養因子(BDNF)は脳内に多量に発現しており、神経細胞に対し、強い生存維持活性をもつことが知られている。これまでに電位依存性Ca^<2+>チャネルの開口に伴う神経細胞内へのCa^<2+>の流入がBDNFのmRNAの発現を増加することが報告されていた。今回、本反応にCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素II(CaMキナーゼII)が関与する可能性について検討した。すなわち、モデル系として、CaMキナーゼIIの中で神経細胞の核内に存在するアイソフォームであるアルファBやデルタ3をNG108-15細胞に過剰発現させた。1.NG108-15細胞では、BDNFのmRNAの中でエキソンIVを含むBDNF(IV-BDNF)のmRNAが多量に発現していた。2.定量RT-PCR法による検討では電位依存性Ca^<2+>1チャネルを開口させるBay-K8644の処理により、IV-BDNFのmRNAが増加した。3.アルファBやデルタ3の過剰発現によりIV-BDNFのmRNAの増加が有意に増強された。核内に移行しないデルタ1の過剰発現では増強効果は認められなかった。4.酵素のATP結合部位のアミノ酸を置換させ、活性をもたない変異体を作製した。得られた変異体の過剰発現ではIV-BDNFのmRNAの発現増強は認められなかった。5.ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とし、IV-BDNFのプロモーター活性を検討した。ルシフェラーゼ活性はアルファBやデルタ3の過剰発現により増強された。6.免疫染色法によりBDNF蛋白質の発現について検討した。核内にアルファBやデルタ3を過剰発現する細胞のみがBDNFに対する抗体で強く染色された。今回の結果から、神経細胞内へのCa^<2+>の流入によるBDNFの発現に核内に存在するCaMキナーゼIIが関与することが明らかになった。今後、神経細胞死の防御への応用を検討する予定である。

脑源性神经营养因子（BDNF）在大脑中大量表达，并且已知对神经细胞具有很强的生存维持活性。先前已报道，由于电压门控Ca 2+ 通道的开放，Ca 2+ 流入神经元增加了BDNF mRNA的表达。在此，我们研究了Ca 2+ /钙调蛋白依赖性蛋白磷酸化酶II(CaM激酶II)参与该反应的可能性。具体而言，作为模型系统，神经细胞核中存在的 CaM 激酶 II 亚型 alpha B 和 delta 3 在 NG108-15 细胞中过度表达。 1.在NG108-15细胞中，BDNF mRNA中含有外显子IV（IV-BDNF）的BDNF mRNA大量表达。 2.在定量RT-PCR分析中，用打开电压依赖性Ca^2+1通道的Bay-K8644处理，增加了IV-BDNF的mRNA。 3.αB和delta3的过表达显着增强了IV-BDNF mRNA的增加。 delta1 的过度表达没有观察到增强效应，它不会转位到细胞核中。 4.通过替换酶的ATP结合位点中的氨基酸来产生无活性的突变体。当获得的突变体过表达时，没有观察到IV-BDNF mRNA的表达增强。 5.使用荧光素酶基因作为报告基因检查IV-BDNF的启动子活性。 αB 和 delta3 的过度表达增强了荧光素酶活性。 6.免疫染色检测BDNF蛋白表达。只有细胞核中过度表达 alphaB 和 delta3 的细胞才会被 BDNF 抗体强烈染色。目前的结果表明，由于Ca 2+ 流入神经细胞，细胞核中存在的CaM激酶II参与BDNF的表达。未来，我们计划考虑将其应用于预防神经细胞死亡。

项目成果

Ogata, N.: "Involvement of protein kinase C in superoxide anion-induced activation of nuclear factor-κB in human endothelial cells."Cardiovasc. Res.. 45. 513-521 (2000)

Ogata, N.：“蛋白激酶 C 参与超氧阴离子诱导的人内皮细胞核因子-κB 激活。”Cardiovasc. 45. 513-521 (2000)

Takeuchi. Y.: "Nuclear localization of the δ subunit of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in rat cerebellar granule cells."J. Neurochem.. 72. 815-825 (1999)

Takeuchi. Y.：“大鼠小脑颗粒细胞中 Ca^2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II 的 δ 亚基的核定位。”J. Neurochem. 72. 815-825 (1999)

Nakai, M.: "Amyloid β protein (25-35) phosphorylates MARCKS through tyrosine kinase-activated protein kinase C signaling pathway in microglia."J. Neurochem.. 72. 1179-1186 (1999)

Nakai, M.：“β 淀粉样蛋白 (25-35) 通过小胶质细胞中酪氨酸激酶激活的蛋白激酶 C 信号通路磷酸化 MARCKS。J. Neurochem.. 72. 1179-1186 (1999)

Ohmitsu, M.: "Phosphorylation of myristoylated alanin-rich protein kinase C substrate by mitogen-activated protein kinase in cultured rat hippocampal neurons following stimulation of glutamate receptors."J. Biol. Chem.. 274. 408-417 (1999)

Ohmitsu, M.：“在刺激谷氨酸受体后，培养的大鼠海马神经元中丝裂原激活蛋白激酶对肉豆蔻酰化富含丙氨酸的蛋白激酶 C 底物进行磷酸化。”J.

Takeuchi, Y.: "Identification of the isoforms of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in rat astrocytes and their subcellular localization."J. Neurochem.. (in press). (2000)

Takeuchi, Y.：“大鼠星形胶质细胞中Ca^2/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II亚型的鉴定及其亚细胞定位。”J.