神経細胞死とカルモデュリン依存性細胞骨格蛋白質燐酸化反応の分子細胞生物学的研究

神经元细胞死亡和钙调蛋白依赖性细胞骨架蛋白磷酸化的分子细胞生物学研究

基本信息

批准号：
06680762
负责人：
山本秀幸
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

平成5年度にPC12細胞を用いて、マウスCaMキナーゼIIアルファーサブユニットを大量に発現する複数の安定なクローン細胞の確立に成功した。得られたクローン細胞を用いて、以下の実験を行なった。1)CaMキナーゼIIアルファーサブユニットに対するcDNAを用いて、ノーザンブロットを施行した。クローン細胞では、CaMキナーゼIIアルファーサブユニットのmRNAの発現が確認された。野生型PC12細胞のCaMキナーゼIIのmRNAは本プローブでは検出されなかった。2)脳のCaMキナーゼIIに対する抗体を用いてイムノブロットを施行した。クローン細胞ではCaMキナーゼIIアルファーサブユニットの発現が確認された。野生型PC12細胞では抗体との反応性が弱く、PC12細胞内に、脳とは異なるアイソザイムの存在が示唆された。3)PCR法によりラットCaMキナーゼIIの4種類のサブユニットのcDNAを得た。野生型PC12細胞ではアルファーサブユニット以外の発現が確認された。4)クローン細胞では微小管付随蛋白質2(MAP2)の燐酸化反応が増強された。本反応は、細胞内カルシウム濃度を増加させる刺激により著しく促進された。5)野生型細胞では細胞内カルシウム濃度を増加させる刺激によりMAP2の燐酸化は著明に減少した。サイクロスポリンを用いた実験から、本脱燐酸化反応にはカルシニューリンが関与することが示唆された。6)細胞をdibutyryl cyclic AMPで処理した場合の神経突起伸展がクローン細胞では著明に抑制された。この抑制は酵素の発現量と相関した。以上の結果より、過剰発現されたCaMキナーゼIIがMAP2の燐酸化を増強させること、及び、神経細胞の形態変化に影響を与えることが明らかとなった。今後、本酵素の細胞死に対する影響を検討する予定である。

1993年，我们利用PC12细胞，成功建立了多个表达大量小鼠CaM激酶IIα亚基的稳定克隆。使用获得的克隆细胞进行以下实验。 1) 使用 CaM 激酶 II α 亚基的 cDNA 进行 Northern 印迹。 CaM 激酶 II α 亚基 mRNA 的表达在克隆细胞中得到证实。该探针未检测到野生型 PC12 细胞中的 CaM 激酶 II mRNA。 2) 使用抗脑 CaM 激酶 II 的抗体进行免疫印迹。 CaM 激酶 II α 亚基的表达在克隆细胞中得到证实。野生型 PC12 细胞与抗体的反应性较弱，表明 PC12 细胞中存在与大脑中不同的同工酶。 3)通过PCR方法获得大鼠CaM激酶II 4个亚基的cDNA。在野生型PC12细胞中证实了α亚基以外的物质的表达。 4) 克隆细胞中微管相关蛋白2 (MAP2) 的磷酸化增强。增加细胞内钙浓度的刺激显着促进了该反应。 5) 在野生型细胞中，MAP2 的磷酸化因增加细胞内钙浓度的刺激而显着降低。使用环孢菌素的实验表明钙调神经磷酸酶参与了这种去磷酸化反应。 6)当细胞用二丁酰环AMP处理时，克隆细胞中的神经突生长被显着抑制。这种抑制与酶的表达水平相关。上述结果表明，过表达的CaM激酶II增强MAP2的磷酸化，影响神经细胞的形态变化。未来，我们计划研究这种酶对细胞死亡的影响。