カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIの神経細胞内局在とシナプス機能の調節

钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II 的神经元定位和突触功能的调节

基本信息

批准号：
12031218
负责人：
山本秀幸
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

カルシウム/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMキナーゼII)には4種類のサブユニットの遺伝子が存在する。さらに、それぞれのサブユニットには可変領域のスプライシングの違いにより複数のアイソフォームが存在する。われわれはデルタサブユニットの中のデルタ2アイソフォームが様々な種類の培養細胞において多量に発現していることを見出した。今回、それぞれの培養細胞においてデルタ2の細胞内局在部位を検討した。さらに、インスリン分泌細胞であるMIN6細胞を用いて、デルタ2が神経伝達物質やホルモン分泌に関与する可能性を検討した。1.ラット脳の培養アストロサイトとNG108-15細胞での共焦点レーザー顕微鏡による観察では、デルタ2の局在部位は小胞体とゴルジ体に一致していた。2.MIN6細胞での検討では、1)単離したインスリン分泌顆粒上に、デルタ2とシナプシンIbが局在した。2)デルタ2をMIN6細胞に過剰発現させた後の高濃度グルコースやトルブタマイドの処理により、デルタ2の活性化とインスリン分泌が相関して増強した。3)CaMキナーゼIIはシナプシンIbの566番目と603番目のセリン残基を燐酸化することが知られている。これらの部位が燐酸化されたシナプシンIに対する燐酸化特異抗体を作製した。作製した燐酸化特異抗体を用いて免疫ブロットを行うと、高濃度グルコースやトルブタマイドの処理によりシナプシンIの燐酸化反応が増加した。デルタ2の過剰発現により本反応がさらに増強された。4)点突然変異法により触媒活性のない変異酵素を作製した。作製した変異酵素の過剰発現ではシナプシンIの燐酸化もインスリン分泌反応も増加しないことを確認した。これらの結果は、デルタ2が小胞輸送に伴って分泌顆粒上に移行し、シナプシンIの燐酸化反応を介して、神経伝達物質放出などのシナプス機能やホルモン分泌に関与することを示している。

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaM 激酶 II) 具有四个亚基的基因。此外，由于可变区剪接的差异，每个亚基具有多种亚型。我们发现δ亚基的δ2亚型在各种类型的培养细胞中大量表达。这次，我们研究了每个培养细胞中 delta2 的细胞内定位位点。此外，使用胰岛素分泌细胞 MIN6 细胞，我们研究了 delta2 参与神经递质和激素分泌的可能性。 1.培养的大鼠脑星形胶质细胞和NG108-15细胞的激光共聚焦显微镜观察表明，delta2的定位位点与内质网和高尔基体重合。 2. 在 MIN6 细胞中，1) Delta 2 和突触蛋白 Ib 位于分离的胰岛素分泌颗粒上。 2)在MIN6细胞中过表达Delta2后，用高浓度葡萄糖或甲苯磺丁脲处理以相关方式增强Delta2激活和胰岛素分泌。 3) 已知 CaM 激酶 II 可使突触蛋白 Ib 的 566 和 603 位丝氨酸残基磷酸化。产生了针对突触蛋白 I 的磷酸化特异性抗体，该抗体在这些位点被磷酸化。当使用制备的磷酸化特异性抗体进行免疫印迹时，突触蛋白I的磷酸化反应通过用高浓度葡萄糖或甲苯磺丁脲处理而增强。 delta2 的过度表达进一步增强了这种反应。 4)通过点突变的方法制备了无催化活性的突变酶。我们证实，突触蛋白 I 磷酸化和胰岛素分泌反应均不会因构建的突变酶的过度表达而增加。这些结果表明，delta2在囊泡运输过程中被转移到分泌颗粒上，并通过突触蛋白I的磷酸化反应参与神经递质释放和激素分泌等突触功能。