免疫グロブリン遺伝子導入マウスを利用したヒト型高親和性抗体の作製と抗体遺伝子解析

利用免疫球蛋白转基因小鼠制备高亲和力人抗体并进行抗体基因分析

基本信息

批准号：
10877080
负责人：
赤水尚史
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスを用いて、ヒト型抗TSH受容体抗体の作製と同抗体遺伝子解析を試みている。本年度は、抗原であるTSH受容体の精製と解析をさらにすすめた。TSH受容体蛋白として、バキュロウイルス系のシステムによつて大量発現精製し、これを精製している。すなわち、我々はこれまでに以下の方法によりC末端にHis tagを融合させた可溶型TSHRの作成を行った。この方法によつて、我々は初めて細胞の培養上に可溶性TSHRを分泌させることに成功した。また、ヒトTSHRあるいはバキュロウイルスgp67蛋白質のシグナル配列を付加したTSHRの細胞外ドメインをコードするsTSHR-Wild(aa1-410)、sTSHR-gp(aa21-410)を作製し、その発現、性状を比較検討した。その結果、sTSHR-Wild及びsTSHR-gpは細胞上清画分から約58KDa、細胞抽出画分から約62、49KDaの蛋白質として検出された。両面分の可溶型TSHRのサイズの違いを検討するため、グリコシダーゼを用いて糖鎖の同定を行ったところ、細胞抽出画分の可溶型TSHRはハイマンノース型糖鎖を、細胞上清画分の可溶型TSHRは欠失型ハイマンノース型糖鎖を持っていた。さらにバセドウ病患者血清中の抗TSHR抗体との結合性を検討したところ、両面分から得られたsTSHR-Wild、sTSHR-gpどちらも抗TSHR抗体と結合したが、sTSHR-gpの方が抗体結合が高かった。また、TSHに対する結合性はsTSHR-gpの細胞上清画分にのみ確認された。これらのことから可溶性TSHRの細胞上清の分泌性には付加される糖鎖が重要であるが、抗体との結合には影響を与えないものと思われた。しかしシグナル配列の違いにより抗体結合性に差が生じたことから、バキュロウイルスのシグナル配列を付加した方がよりnativなTSHRを作製できるものと考えられた。ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ゼノマウス(XenoMouse II)供給を日本たばこ産業株式会社医薬研究所・久保田から供給してもらうめどがついた。

我们正在尝试生成人类抗 TSH 受体抗体，并使用人类免疫球蛋白转基因小鼠分析该抗体的基因。今年，我们进一步推进了抗原TSH受体的纯化和分析。使用杆状病毒系统表达和纯化大量TSH受体蛋白。也就是说，我们之前使用以下方法创建了可溶性 TSHR，其 C 末端融合了 His 标签。利用这种方法，我们首次成功地将可溶性TSHR分泌到培养细胞中。此外，我们还创建了 sTSHR-Wild (aa1-410) 和 sTSHR-gp (aa21-410)，它们用人 TSHR 或杆状病毒 gp67 蛋白的信号序列编码 TSHR 的胞外结构域，并比较了它们的表达和特性。考虑了一下。结果，在细胞上清级分中检测到sTSHR-Wild和sTSHR-gp为约58KDa的蛋白质，在细胞提取级分中检测为约62和49KDa的蛋白质。为了考察两侧可溶性TSHR大小的差异，我们利用糖苷酶对糖链进行鉴定，发现细胞提取部分的可溶性TSHR含有高甘露糖型糖链，而细胞上清部分含有高甘露糖型糖链。 TSHR 的可溶形式具有缺失的高甘露糖型糖链。此外，当我们检查格雷夫斯病患者血清中的抗TSHR抗体的结合特性时，从两侧获得的sTSHR-Wild和sTSHR-gp都与抗TSHR抗体结合，但sTSHR-gp显示出更高的抗体结合。昂贵的。此外，仅在sTSHR-gp的细胞上清部分中证实了与TSH的结合。这些结果表明，添加到可溶性TSHR中的糖链对于细胞上清液的分泌很重要，但不影响与抗体的结合。然而，由于信号序列的差异导致抗体结合特性的差异，因此认为可以通过添加杆状病毒信号序列来产生更天然的TSHR。我们现在有望从日本烟草公司药物研究所和久保田获得转染人免疫球蛋白基因的 XenoMouse (XenoMouse II)。