葉緑体RNAエディティング酵素の同定と作用部位認識機構

叶绿体RNA编辑酶的鉴定及作用位点识别机制

基本信息

  • 批准号:
    10174217
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.09万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
  • 财政年份:
    1998
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1998 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

今年度は葉緑体のRNAエディティングの分子機構について明らかにするために以下の事柄について解析を行った。1. 昨年度開発に成功した葉緑体in vitro RNAエディティング系の諸条件を詳細に至適化し効率よく、再現性の高いin vitro系を確立した。RT-PCR法を用いてin vitroエディティング反応後の基質RNAから特異的cDNAを増幅し、プラスミドベクターにクローニング後DNA塩基配列解析をした結果、in vitroエディティング反応は正確なエディティング部位のみで起こっていることが確認された。2. in vitroエディティング系を用いてエディティングのシス配列とトランス因子の解析を行った。部位特異的変異や欠失変異を導入した基質RNA(psbL,ndhB mRNA)を合成しin vitroエディティング効率を測定したところ、エディティング配列上流16nt、下流10ntがpsbLのエディティングに重要であること、ndhBの場合は上流配列のみが重要で下流配列は必要ないことを見出した。RNAオリゴヌクレオチドを用いた競争阻害実験によりトランス因子がpsbLとndhB mRNAのエディティング部位上流に相互作用することを明らかにした。さらに交差競争阻害実験によりそれぞれのトランス因子は部位特異的であることを見出した。3. エディティング系のマイクロコッカルヌクレアーゼ処理、AMTクロスリンク法により、トランス因子は他のエディティング系で見出されているようなガイドRNAではなくタンパク質因子である可能性が高いことが示された。4. UVクロスリンク法によりエディティング部位とその上流近傍領域に特異的結合するRNA結合タンパク質の検出に成功した。以上の結果から全く未知であった葉緑体RNAエディティングの機構が明らかになり始めた。
今年,我们分析了以下项目,以阐明叶绿体中RNA编辑的分子机制。 1.对我们去年成功研发的叶绿体体外RNA编辑系统的条件进行了详细优化,建立了高效、高重复性的体外系统。利用RT-PCR方法,从体外编辑反应后的底物RNA中扩增出特异性cDNA,并克隆至质粒载体后,分析DNA碱基序列。 2.使用体外编辑系统,我们分析了顺式编辑序列和反式因子。当我们合成引入位点特异性突变或缺失突变的底物RNA(psbL,ndhB mRNA)并测量体外编辑效率时,我们发现编辑序列上游16 nt和下游10 nt对于psbL编辑很重要。在 ndhB 的情况下,我们发现只有上游序列很重要,下游序列不是必需的。使用 RNA 寡核苷酸的竞争性抑制实验表明,反式因子在 psbL 和 ndhB mRNA 编辑位点的上游相互作用。此外,交叉竞争抑制实验表明,每种反式因子都是位点特异性的。 3.编辑系统的微球菌核酸酶处理和AMT交联方法表明,反式因子很可能是蛋白质因子,而不是其他编辑系统中发现的指导RNA。 4.我们利用紫外交联成功检测到一种与编辑位点及其上游区域特异性结合的RNA结合蛋白。从上述结果来看,叶绿体RNA编辑这一完全未知的机制已经开始变得清晰起来。

项目成果

期刊论文数量(3)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Tetsuro Hirose: "Tronslation of tobacco chloroplase vps14 mRNA depends on a Shine-Dalgarnc-like soquence in the 5'-untronslated region but not on internal RNA editing in the coding region" FEBS Letters. 430. 257-260 (1998)
Tetsuro Hirose:“烟草叶绿体 vps14 mRNA 的翻译依赖于 5-未翻译区域中的 Shine-Dalgarnc 样序列,但不依赖于编码区域中的内部 RNA 编辑”FEBS Letters。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Masahiro Sugiura: "Evolution and mechanism of translation in chloroplasts" Annual Review of Genetics. 32. 437-459 (1998)
Masahiro Sugiura:“叶绿体的进化和翻译机制”遗传学年度评论。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Tetsuro Hirose: "The chloroplast infA gene with a UUG initiation codon" FEBS Letters. 445. 169-172 (1999)
Tetsuro Hirose:“带有 UUG 起始密码子的叶绿体 infA 基因”FEBS Letters。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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