新規核内RNAノックダウン法の確立

一种新型核RNA敲低方法的建立

基本信息

批准号：
19657054
负责人：
廣瀬哲郎
金额：
$ 2.24万
依托单位：
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続きヒトの培養細胞に合成キメラオリゴヌクレオチドを導入することによって、核内RNAを特異的にノックダウンする実験系の条件至適化などを行った。ノックダウン用のアンチセンス・キメラオリゴヌクレオチドの標的特異性を実験的に証明するために、標的とのミスマッチを1塩基ずつ増やしたオリゴヌクレオチドを用いてノックダウン効率を測定したところ、非常に特異性が高く標的RNAを認識し分解できることが示された。ノックダウンを標的核内ノンコーディングRNAに対して引き続き試行し、新たに10種類以上の新しいncRNA種のノックダウンに成功した。一方で、マイナースプライセオソームを構成するU11,U12,U4atac,U6atacは、ノックダウンの効率が著しく低い事も同時に明らかになった。これらのsnRNPは非常にコンパクトなRNA-タンパク質複合体であるので、結合蛋白質によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が阻害された可能性が高い。この他にノックダウン効果による細胞表現型の変化をU7 snRNAと核内構造体に局在するMENαとMENε/βについて解析した。その結果U7 snRNAのノックダウンでは、昨年度報告した異常なヒストンmRNAの蓄積と細胞周期の遅延、さらに新たにS期外でのヒストンmRNAの異常な蓄積が観察された。MENαのA549細胞でのノックダウンでは、近傍のMENε/βncRNAの蓄積量が減少することが示された。MENε/βのノックダウンでは、このRNAの局在場部位である構造体が消失することが明らかになった。こうして2年間に渡る解析によって、アンチセンスキメラオリゴヌクレオチドによる核内ノックダウンの実験系は、その効率、特異性、更に引き起こされる効果の確実性などにおいて解析系として有用である事が示された(論文をminor revision中)。

继去年之后，我们通过将合成的嵌合寡核苷酸引入培养的人类细胞中，优化了专门敲除核 RNA 的实验系统的条件。为了通过实验证明反义嵌合寡核苷酸敲低的靶标特异性，我们使用与靶标错配增加1个碱基的寡核苷酸测量了敲低效率，发现敲低效率非常特异，表明靶RNA可以。受到高度认可和贬低。我们继续尝试敲除靶向核非编码RNA，并成功敲除10多个新的ncRNA物种。另一方面，还发现构成次要剪接体的U11、U12、U4atac和U6atac的敲低效率极低。由于这些 snRNP 是非常紧凑的 RNA-蛋白质复合物，因此反义寡核苷酸的结合可能受到结合蛋白的抑制。此外，我们还分析了由于 U7 snRNA 和位于核结构中的 MENα 和 MENε/β 的敲低效应导致的细胞表型变化。结果，当U7 snRNA被敲低时，我们观察到了我们去年报道的异常组蛋白mRNA积累和细胞周期延迟，以及S期之外新的组蛋白mRNA异常积累。 A549 细胞中 MENα 的敲除可减少附近累积的 MENε/β ncRNA 的量。研究表明，MENε/β 的敲除会消除作为该 RNA 定位场位点的结构。经过两年的分析，结果表明，使用反义嵌合寡核苷酸的核敲低实验系统作为分析系统，其效率、特异性和所造成的效果的确定性是有用的（论文正在进行小修改）。