赤血球酵素異常症・発現したタンパクによる変異酵素の機能解析

红细胞酶紊乱/基于表达蛋白的突变酶的功能分析

基本信息

批准号：
08671263
负责人：
藤井寿一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

グルコースリン酸イソメラーゼ(GPI)異常症は解糖系酵素異常による遺伝性溶血性貧血で、世界で40家系以上が報告されている常染色体劣性遺伝性疾患である。GPIの多様な構造変異が遺伝性溶血性貧血の原因となることが明らかになってきたが、GPIはその機能ドメインが未だ不明確で、遺伝子変異・酵素機能異常と病態との関係は十分に解明されていない。そこで今年度はヒトGPIの大腸菌体内での発現系を構築し、組み換え型ヒトGPIをヒト赤血球GPIとの酵素学的諸性質を比較検討した。さらにGPI異常症の原因となる点突然変異を有する変異GPIを発現・精製して、酵素学的諸性質と遺伝子変異・臨床像との関連を検討した。ヒト網赤血球より単離したGPIcDNAをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として大腸菌体内で発現させた。GST-GPI融合タンパクはモル当たり比活性が、赤血球GPIの約80%に低下していたが、基質であるグルコース 6ーリン酸(G6P)・フルクトース 6ーリン酸(F6P)に対する親和性は赤血球GPIとほぼ同一であった。変異GPIの比活性・基質親和性・熱安定性を正常対照と比較検討したところ、N末端の変異T51は比活性が正常の約70%に低下し、さらに熱に対して著しく不安定な性質を示した。急性溶血発作を示さないバリアントT224Mは比活性が正常の約85%で、熱に対する不安定性は他の変異に比して軽度であり、基質G6Pに対する親和性は正常より強いことが明らかになった。Q343R・D539Nの各バリアントは熱に不安定な性質と共に、基質親和性の低下を認めたが、Q343RはG6P・F6Pの両方、D539NはF6Pに対する親和性のみが有意に低下していた。以上、検討した4種の変異GPIは共通して熱に対して不安定であったが、熱安定性の程度および基質F6Pに対する低親和性が急性溶血発作の有無に相関することが示唆された。

磷酸葡萄糖异构酶（GPI）疾病是一种由糖酵解酶疾病引起的遗传性溶血性贫血，是一种常染色体隐性遗传疾病，已在全球 40 多个家庭中报告。现已明确，GPI的各种结构突变会导致遗传性溶血性贫血，但GPI的功能域仍不清楚，基因突变、酶功能障碍和病理状况之间的关系尚未完全阐明。因此，今年，我们构建了人GPI在大肠杆菌中的表达系统，并比较了重组人GPI与人红细胞GPI的酶学特性。此外，我们表达并纯化了具有导致 GPI 异常的点突变的突变 GPI，并研究了酶特性、基因突变和临床症状之间的关系。从人网织红细胞中分离的 GPI cDNA 在大肠杆菌中表达为与谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 的融合蛋白。虽然GST-GPI融合蛋白的比摩尔活性比红细胞GPI低约80%，但其对底物葡萄糖6-磷酸（G6P）和果糖6-磷酸（F6P）的亲和力与红细胞GPI相似他们几乎一模一样。当我们将突变体GPI的比活性、底物亲和力和热稳定性与正常对照进行比较时，我们发现N端突变体T51的比活性比正常对照低约70%，并且也极不稳定以热显示。变异体T224M不表现出急性溶血发作，其比活性约为正常体的85%，对热的不稳定性比其他突变体更轻微，并且对底物G6P的亲和力比正常体更强。 Q343R和D539N的每种变体都表现出热不稳定特性以及底物亲和力的降低，但Q343R对G6P和F6P的亲和力均显着降低，而D539N仅对F6P的亲和力显着降低。如上所述，所检测的四种突变型GPI均对热不稳定，但表明热稳定性的程度和对底物F6P的低亲和力与急性溶血发作的存在或不存在相关。