赤血球酵素異常症・発現したタンパクによる変異酵素の機能解析

红细胞酶紊乱/基于表达蛋白的突变酶的功能分析

基本信息

批准号：
08671263
负责人：
藤井寿一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

グルコースリン酸イソメラーゼ(GPI)異常症は解糖系酵素異常による遺伝性溶血性貧血で、世界で40家系以上が報告されている常染色体劣性遺伝性疾患である。GPIの多様な構造変異が遺伝性溶血性貧血の原因となることが明らかになってきたが、GPIはその機能ドメインが未だ不明確で、遺伝子変異・酵素機能異常と病態との関係は十分に解明されていない。そこで今年度はヒトGPIの大腸菌体内での発現系を構築し、組み換え型ヒトGPIをヒト赤血球GPIとの酵素学的諸性質を比較検討した。さらにGPI異常症の原因となる点突然変異を有する変異GPIを発現・精製して、酵素学的諸性質と遺伝子変異・臨床像との関連を検討した。ヒト網赤血球より単離したGPIcDNAをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として大腸菌体内で発現させた。GST-GPI融合タンパクはモル当たり比活性が、赤血球GPIの約80%に低下していたが、基質であるグルコース 6ーリン酸(G6P)・フルクトース 6ーリン酸(F6P)に対する親和性は赤血球GPIとほぼ同一であった。変異GPIの比活性・基質親和性・熱安定性を正常対照と比較検討したところ、N末端の変異T51は比活性が正常の約70%に低下し、さらに熱に対して著しく不安定な性質を示した。急性溶血発作を示さないバリアントT224Mは比活性が正常の約85%で、熱に対する不安定性は他の変異に比して軽度であり、基質G6Pに対する親和性は正常より強いことが明らかになった。Q343R・D539Nの各バリアントは熱に不安定な性質と共に、基質親和性の低下を認めたが、Q343RはG6P・F6Pの両方、D539NはF6Pに対する親和性のみが有意に低下していた。以上、検討した4種の変異GPIは共通して熱に対して不安定であったが、熱安定性の程度および基質F6Pに対する低親和性が急性溶血発作の有無に相関することが示唆された。

磷酸葡萄糖异构酶（GPI）异常是由糖酵解酶异常引起的遗传性溶血性贫血，这是全球40多个家庭中报道的常染色体隐性遗传疾病。很明显，GPI中的各种结构突变会引起遗传性溶血性贫血，但是GPI的功能域仍然不清楚，遗传突变与酶异常和病理之间的关系尚未完全了解。因此，今年，我们在大肠杆菌细胞内构建了人类GPI的表达系统，并比较并检查了重组人GPI的酶促特性与人红细胞GPI。此外，表达并纯化具有引起GPI异常的点突变的突变突变，以检查酶特性与遗传突变与临床特征之间的关系。从人片肠球泡细胞中分离出的GPICDNA在大肠杆菌细胞中以谷胱甘肽-S-转移酶（GST）为融合蛋白表达。每摩尔的GST-GPI蛋白的特异性活性降低至大约80％的红细胞GPI，但是对底物葡萄糖六磷酸（G6P）和六磷酸果实（F6P）的亲和力几乎与ERTHROCYTE GPI相同。当将突变体GPI的特定活性，底物亲和力和热稳定性与正常对照进行比较时，N末端突变体T51的特异性活性降低到正常水平的约70％，并且还显示出明显的不稳定性能，以相对于热量。不表现出急性溶血攻击的变体T224M的特异性活性约为正常的85％，比其他突变具有温和的热量不稳定性，并且其对底物G6P的亲和力大于正常。 Q343R和D539N的变体既具有热敏感性，又降低了底物亲和力，但是Q343R的G6P和F6P均显着降低，而D539N对F6P的亲和力显着降低。上面提到的表明，检查的四个突变体GPI通常不稳定，但是底物F6P的热稳定性和低亲和力与存在或不存在急性溶血攻击的情况相关。