赤血球酵素異常症の病因解明とモデルマウスを用いた新しい治療法の検討

利用模型小鼠阐明红细胞酶紊乱的发病机制并研究新的治疗方法

• 批准号: 07671225
• 负责人: 藤井 寿一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671225/
• 关键词: 溶血性貧血; 赤血球酵素異常症; ピルビン酸キナーゼ異常症; モデルマウス; ミスセンス変異; 転写因子; トランスジェニックマウス; エリスロポエチン; 溶血性貧血; 赤血球酵素異常症; ピルビン酸キナーゼ異常症; モデルマウス; ミスセンス変異; 転写因子; トランスジェニックマウス; エリスロポエチン

CBAマウス純系コロニー内に自然発症した遺伝性溶血性貧血症の原因を明らかにするため、赤血球酵素活性および解糖中間体の測定、赤血球・肝臓抽出液のイムノブロット解析、肝臓抽出液のアイソザイム解析を行ない、この貧血がピルビン酸キナーゼ(PK)異常によることを決定した。次いでRACE法にてCBA系マウス骨髄mRNAからマウス赤血球(R)型PKcDNAクローニングを行い、得られた配列をもとに異常マウスの分子異常を解析した。PK異常マウスではR型PKの活性中心にG338D置換が明らかになり、活性中心の構造変化により基質親和性が低下し、赤血球内の生理的基質濃度におけるPK活性がほとんど消失したものと結論できた。このPK異常モデルマウスを用いて、赤血球酵素異常症の貧血に対する内因性エリスロポエチンの増加による代償作用の関与、薬理量のエリスロポエチン単独投与、ないしエリスロポエチンとbutyrateやhydorxyureaを用いて構造上正常な他のアイソザイムの強制発現による治療効果を検討する為に、今年度はPKのR型アイソザイムの細胞特異的発現調節機構を解明した。先ず、肝(L)型PK遺伝子上流のDNasel高感受性領域を検索し、次いでヒト遺伝子ライブラリーより単離したPK遺伝子クローンの塩基配列をR型PKの転写開始部位より約7kb上流まで決定した。その結果、PK遺伝子転写開始部位の上流約4kbに赤芽球系細胞特異的なDNasel高感受性領域を同定し、その領域の約700bp内に4つのGATA、4つのCACCC、さらに分化段階特異的転写因子NF-E4の認識配列を同定した。現在、ヒトL型遺伝子の第1・2エクソンおよびその5′上流域約8kbを含む遺伝子断片とヒトR型PkcDNAおよび3′領域約2.6kbに存在するAP-1サイトを用いて、ヒト赤血球型PKミニ遺伝子を構築し、PK異常マウスの受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを作製している。

To clarify the cause of hereditary hemolytic anemia that occurred spontaneously within pure CBA mice colonies, we performed measurements of erythrocyte enzyme activity and glycolytic intermediates, immunoblot analysis of erythrocyte and liver extracts, and isozyme analysis of liver extracts, and determined that this anemia was caused by abnormal pyruvate kinase (PK).接下来，使用种族方法从基于CBA的小鼠骨髓mRNA克隆小鼠红细胞（R）型PK cDNA，并根据获得的序列分析异常小鼠的分子异常。在PK异常小鼠中，在R型PK的活性中心揭示了G338D取代，并且活性中心的结构变化降低了底物亲和力，导致PK活性几乎所有在细胞内生理底物浓度下消失的消失。 Using this model of PK abnormality model, we have elucidated the cell-specific expression regulatory mechanism of R-type isozymes of PK to investigate the involvement of the compensatory effect of increased endogenous erythropoietin in the anemia of erythropoietin, administration of pharmacological amounts of erythropoietin alone, or forced expression of other structurally normal isozymes using erythropoietin和丁酸酯和羟基脲。首先，搜索了肝脏（L）型PK基因上游的DNASEL敏感区域，并确定了从人基因文库中分离出的PK基因克隆的基本序列，确定了R型PK的转录起始位点的大约7 kb。结果，在PK基因转录起始位点上游鉴定了针对红细胞细胞的高度敏感的DNASEL区域，在大约700 bp的区域内鉴定了四个GATA，四个CACCC，四个CACCC，四个CACCC的识别序列，并鉴定出分化阶段特异性的转录因子NF-E4。目前，使用人类L型基因的第一和第二个外显子和5'上游区域，使用人R型PKCDNA和位于3'区域的AP-1位置建造人类红细胞型PK小型，并在3'kb的3'区域中构建了5'上游区域，并将其注射到PK abbnormal transemalmal ciale transegenalmalemalsic mice中。