CD38ノックアウトマウスによるサイクリックADPリボースの膵β細胞機能の解明

使用 CD38 敲除小鼠阐明胰腺 β 细胞中环状 ADP 核糖的功能

基本信息

批准号：
08670161
负责人：
加藤一郎
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らはこれまで、NADの代謝産物である「サイクリックADPリボース」が、膵β細胞の細胞内セカンドメッセンジャーとしてインスリン分泌を司ることを明らかにしてきた。最近、CD38蛋白が、サイクリックADPリボースを合成・分解する酵素活性を持つことから、CD38が、細胞内サイクリックADPリボース量を制御することにより膵β細胞内Ca^<2+>濃度を制御し、インスリン分泌・合成能を制御する可能性が示唆されてきた。膵β細胞におけるCD38蛋白の機能を明らかにするため、遺伝子標的法を用いてマウスCD38遺伝子をノックアウトしたマウスを作製することを目的として、以下のとおり実験が進行した。(1)マウスCD38遺伝子のエキソン1を含む15Kbのゲノム遺伝子断片を単離し、その構造を決定した。(2)上記の遺伝子断片を用いて、CD38遺伝子ノックアウト用ベクターを作製した。(3)ベクターをES細胞に導入し、サザンブロット法により、相同組換を起こした変位ES細胞株を分離した。(4)相同組換えを起こしたES細胞をマウス受精卵に顕微注入してキメラマウスを得た。(5)得られたキメラマウスを普通のマウスと交配し変異遺伝子のgerm-line transmissionを確認した。(6)CD38遺伝子のエキソン1をヘテロに欠失するマウスどうしを交配にかけた。

申请人先前曾表明，NAD代谢产物的“环状ADP核糖”调节胰岛素分泌为胰腺β细胞的第二个细胞内信使。最近，CD38蛋白具有合成和降解环状ADP核糖的酶活性，并且已经提出，CD38可以通过控制细胞内Ca^<2+>的细胞内β细胞内Ca^<2+>通过控制环状核糖内细胞内细胞内的核糖量和控制胰岛素的浓度。为了阐明CD38蛋白在胰腺β细胞中的功能，实验如下进行，其目的是使用基因靶向方法产生小鼠CD38基因。（1）分离了含有小鼠CD38基因的外显子1的15 kb基因组基因片段，并确定其结构。（2）使用上述基因片段制备基因敲除CD38基因的载体。（3）将载体引入ES细胞中，并通过Southern印迹分离出了同源重组的位移ES细胞系。（4）通过微注射将同源性重组成小鼠受精卵的ES细胞获得嵌合小鼠。（5）将获得的嵌合小鼠与普通小鼠配对，以确认突变基因的种系传递。（6）越过CD38基因的异形外显子1的小鼠被跨过。