細胞外サイクリックADPリボースのセンサー機構

细胞外环ADP-核糖的传感机制

基本信息

批准号：
19045011
负责人：
橋井美奈子
金额：
$ 3.78万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

サイクリックADPリボース(cADPR)は、CD38分子により細胞外でβ-NAD^+から作られるセカンドメッセンジャーであり、温度感受性センサーであるTRPM2チャネルを活性化することがわかってきた(Togashi, Tominagaet al. ; 2006, 2008)。今回、(1) 神経細胞において細胞外に投与したcADPRがTRPM2を活性化し細胞内Ca^<2+>濃度上昇をおこすか?(2) CD38にどのような周辺蛋白が結合し、酵素活性を調節するのか(3) 安定かつ細胞外から投与できるcADPRアナログの開発、の3点を調査した。本年度の成果として、まず上記(1) に関して、視床下部の一次培養神経・NG108-15培養神経細胞共に、温度を37Cに上昇させると、細胞外cADPR存在下で顕著な細胞内Ca^<2+>濃度上昇が起こることを見出した。この現象は細胞外β-NAD^+もしくはADPR投与でも出現し、さらに視床下部・NG108-15細胞共にTRPM2のmRNAが発現していることがわかり、神経細胞においてもcADPRがTRPM2チャネルを活性化しCa^<2+>流入を起こすことが予想された。次に上記(2) については、HEK293T細胞にhCD38-HA融合蛋白を発現させ、HA抗体ビーズで免疫沈降、結合蛋白を回収し、2次元電気泳動で分離した。hCD38発現細胞にのみにみられるスポットを切り出し、MALDI-TOF/MS質量分析を行った結果、ATP synthaseなどの3種の酵素が得られた。次に上記(3) に関しては、カーボ型の合成cADPRアナログ(cADPcR : cyclic ADP-carbocyclic ribose)を用いてNG108-15細胞への細胞外投与の効果を調べ、暖温下でやはり細胞内Ca^<2+>濃度上昇を引き起こすことを見出した。

环状ADP核糖（CADPR）是由CD38分子细胞外β-NAD^+制成的第二个使者，已发现激活TRPM2通道（温度敏感传感器）（Togashi，Tominagaet al。; 2006，2008）。在本文中，我们研究了三个点：（1）CADPR是否在神经元中细胞外施用会激活TRPM2并增加细胞内Ca^<2+>浓度？（2）哪种外围蛋白与CD38结合并调节酶活性（3）稳定的，细胞外施用的CADPR类似物的发展。由于今年的结果，我们首先发现，与（1）相关的是，当下丘脑中原代培养神经和NG108-15培养的神经细胞的温度增加到37℃时，细胞内Ca^<2+>浓度显着升高，在细胞外CADPR的情况下会发生。当施用细胞外β-NAD^+或ADPR时，这种现象也出现了，发现TRPM2 mRNA在下丘脑和NG108-15细胞中均表达，并且可以预测CADPR会激活神经元中的TRPM2通道，从而导致Ca^<2+> Implux。接下来，对于上述（2），HCD38-HA融合蛋白在HEK293T细胞中表达，用HA抗体珠免疫沉淀，并收集结合蛋白，并通过2D电泳分离。切除仅在HCD38表达细胞中发现的斑点，并进行MALDI-TOF/MS质谱法以获得三种类型的酶，例如ATP合酶。接下来，关于（3），我们使用碳型合成CADPR类似物（CADPCR：环状ADP-Carbocycle核糖）研究了细胞外施用对NG108-15细胞的影响，并发现在温度温度下，它也会引起细胞内Ca^<2+>的增加。