ウイスル性スーパー抗原による自己免疫疾患発症の機構解明

阐明病毒超抗原引起的自身免疫性疾病发病机制

基本信息

批准号：
07770347
负责人：
中野英樹
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770347/
关键词：
スーパー抗原マウス乳癌ウイルス自己免疫抗原提示 H-2^<sx1>MHC ClassII I-A I-E

项目摘要

内在性マウス乳癌ウイルスMtv-2由来スーパー抗原(SAg)の提示能力のあるDDD/1(H-2^<sx1>,I-A^<sx>)及び、提示能力のないB10.S(H-2^s,I-2^s)マウスのI-A_α及びI-A_βのcDNAをRT-PCR法によりクローニングした。I-A_αの塩基配列を調べた結果、I-A_α^sに比してI-A_α^<sx>では、T_<194>がCに、C_<495>がTに変異していたが、アミノ酸配列はsとsxで差がなく、I-A_α^sのアミノ酸配列は既知のものと一致した。従って、I-A_α^<sx>の構造はI-A_α^sと同一であると考えられた。I-A_β^<sx>の塩基配列は、G_<253>がCに変異しており、その結果、Ala_<85>がProに変異していた。I-A_<β28-123>はD1領域と呼ばれる抗原結合部位であり、各MHC間で高い多型性が見られる。しかし、Ala_<85>はマウスのI-A、I-E及びヒトのHLA DR等全てのMHC ClassII_β分子で保存されている。興味深いことに、Mtv-2と構造を同じくする外来性MMTV(GR)由来SAgを低い活性ながら提示できると報告されているI-A_β^fはPro_<83>がSerに、I-A_β^<NOD>はPro_<83>とAsp_<84>がそれぞれHisとSerに変異している。さらに、I-A_βではTyr_<87>であるのに対して、I-E_βではAsnと両者間で異なっている。以上の結果から、Class II_<β83-87>付近の構造がMtv由来SAgの提示に関与している可能性が示唆された。I-A分子のSAg提示能を調べるため、I-A_α及びI-A_βのcDNAをサイトメガロウイルスのプロモーターを有する発現ベクター(pcDNAIneo)にサブクローニングし、L cellにCo-transfectした。2日後に細胞表面上のI-A分子の発現をflow cytometryによって確認したところ、低レベルの発現が観察された。L cell transfectantにさらにMtv-2SAgcDNAをtransfectし、Vβ15^+T cell hybridoma(KOX15-8.3)とCo-cultureし、その上清中のIL-2量を測定したが、IL-2は検出されなかった。Positive controlとして用いたI-E^k-L cell transfectant(DCEK)は、Mtv-2SAgを提示した。L cellでのI-A遺伝子の発現は、一過性よりも恒常的である方がよい結果が得られると考えられるので、現在、I-A分子を恒常的に高発現する株を作製中である。今後も引き続きI-A分子の構造とSAg提示能について追究する予定である。

来自DDD/1（H-2^<sx1>，I-A^<sx>）的I-A_α和I-A_β的cDNA，具有从内源性小鼠乳腺癌MTV-2，MTV-2，I-A_β和I-A_β和B10.S（H-2^S，I-2^s）的能力中呈现超抗原（SAG）的能力（SAG），而I-a_β和i-a的能力则是I-a_β的能力。 RT-PCR。与I-A_α^s相比，检查了I-A_α的核苷酸序列，并将T_ <194>突变为I-A_α^S中的C_ <495> to，但是S和SX之间的氨基酸序列没有差异，并且与已知的I-A__α^s的氨基酸序列一致。因此，I-A_α^<sx>的结构被认为与I-A_α^S相同。 I-A_β^<sx>的核苷酸序列是将G_ <253>突变为C，因此Ala_ <85>被突变为Pro。 I-A_<β28-123>是一个称为D1区域的抗原结合位点，并且在每个MHC之间观察到高多态性。但是，Ala_ <85>与所有MHCII_β分子（包括小鼠I-A，I-E和人HLA DR）保守。有趣的是，据报道，I-A_β^F具有与MTV-2相同的MTV-2相同结构的外国MMTV（GR）衍生的SAG在I-A_β^F中突变，而I-A_β^f，而I-A_β^<NOD>分别在他的和Ser中突变。此外，在i-a_β中，tyr_ <87>，而在i-e_β中，ASN和两个都不同。上述结果表明，II_<β83-87类附近的结构可能参与了MTV衍生的下垂的表现。为了研究I-A分子的SAG显示能力，将I-A_α和I-A_β的cDNA取代为携带巨细胞病毒启动子的表达载体（PCDNAINEO），然后共转染到L细胞中。两天后，通过流式细胞仪证实了I-A分子在细胞表面上的表达，观察到低水平的表达。将MTV-2SAGCDNA进一步转移到L细胞转染剂中，并与Vβ15^+T细胞杂交瘤共培养（KOX15-8.3），并测量了上清液中IL-2的量，但未检测到IL-2。 I-E^K-L细胞转化剂（DCEK）用作呈阳性对照的MTV-2SAG。由于据认为，I-A基因在L细胞中的表达比瞬态更好，因此我们目前正在制备组成型表达I-A分子的菌株。我们计划继续研究I-A分子的结构和呈现SAG的能力。