糖鎖を認識する白血球接着分子L-セレクチンの新しいリガンドの同定

L-选择素的新配体的鉴定，L-选择素是一种识别糖链的白细胞粘附分子

基本信息

批准号：
06770253
负责人：
川島博人
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770253/
关键词：
接着分子 L-セレクチンリンパ球ホ-ミング

项目摘要

生体内におけるリンパ球のホ-ミング現象は免疫系が秩序正しく機能を発揮するために必須の役割をしており、その特異性の少なくとも一部は白血球上の接着分子L-セレクチン(LECAM-1)が血管内皮細胞上の特定のリガンド分子と結合することにより担われる。私はラットL-セレクチンの細胞外ドメインとヒトIgG_1の定常領域ドメインを遺伝子操作によってつないだキメラ分子(LEC-IgG)をプローブとしてラットリンパ節におけるリガンドの解析を行った。はじめに、リンパ節の組織片のNP-40による可溶化物をWGA-カラムおよびLEC-IgG-カラムに順次かけ精製を進めた。得られた精製画分のSDS-PAGEの結果、160 kDaにほぼ単一なバンドが認められた。約100mgの精製の出発材料から2mgの精製標品が得られた。この分子はその分子量からこれまでに報告のない新たなL-セレクチンのリガンドであるものと考えられた。次に、この160kDaのリガンド分子をNa^<125>Iにより標識した後にL-セレクチンとの反応性を検討した。その結果、^<125>I-標識物はヒトIgG-ビーズには反応せずLEC-IgG-ビーズにのみ反応することよりL-セレクチンに特異的に結合するものと考えられた。また、EDTAおよびL-セレクチンのレクチンドメインに反応する中和抗体HRL1およびHRL3存在下においてL-セレクチンとの反応が阻害されることよりL-セレクチンのレクチンドメインを介して認識されるもの考えられた。非中和抗体HRL2およびHRL4はこのリガンド分子とL-セレクチンとの結合に影響を及ぼさなかった。また、L-セレクチンに結合することの知られているfucoi danやPPMEなどの多糖やsulfatideもこの分子のL-セレクチンとの結合を阻害した。また、このリガンド分子に糖鎖修飾を施した後にL-セレクチンとの反応性を検討したところ、N-グリカナーゼ消化ではわずかに反応性が弱くなるもののほとんど影響しなかったがO-結合型、N-結合型いずれの糖鎖をも切り出すことの知られているTFMS処理により、L-セレクチンとの反応性は完全に消失した。このことより、この分子上のO-結合型糖鎖がL-セレクチンとの結合に重要であるものと考えられた。今後この160kDaのリガンド分子の大量精製を行い、部分アミノ酸配列の決定およびcDNAクローニングを行いたいと考えている。

淋巴细胞在体内的归巢现象对于免疫系统有序发挥作用至关重要，其特异性至少部分归因于白细胞上的粘附分子L-选择素（LECAM-1）负责结合。血管内皮细胞上的特定配体分子。我使用嵌合分子 (LEC-IgG) 作为探针分析了大鼠淋巴结中的配体，该嵌合分子是大鼠 L-选择素胞外域和人 IgG_1 恒定区域的基因工程组合。首先，将NP-40溶解的淋巴结组织片依次应用于WGA柱和LEC-IgG柱进行纯化。对得到的纯化级分进行SDS-PAGE，结果在160kDa处观察到几乎单一的条带。大约 100 mg 用于纯化的起始材料产生 2 mg 纯化的样品。根据其分子量，该分子被认为是一种新的L-选择素配体，迄今为止尚未有报道。接下来，我们用Na^ 125 I标记该160kDa配体分子并检查其与L-选择素的反应性。结果， 125 I标记物质不与人IgG-珠反应，而仅与LEC-IgG-珠反应，这表明它与L-选择素特异性结合。此外，在 EDTA 和与 L-选择素的凝集素结构域反应的中和抗体 HRL1 和 HRL3 存在下，与 L-选择素的反应受到抑制，表明它是通过 L-选择素的凝集素结构域进行识别的。非中和抗体HRL2和HRL4不影响该配体分子与L-选择素的结合。此外，已知与L-选择素结合的岩藻依聚糖和PPME等多糖以及硫苷脂也抑制该分子与L-选择素的结合。此外，当我们检查该配体分子糖基化后与 L-选择素的反应性时，我们发现用 N-聚糖酶消化稍微削弱了反应性，但影响不大； - TFMS 处理已知可以切除任何类型的糖链，完全消除了与L-选择素的反应性。这表明该分子上的 O-连接糖链对于与 L-选择素的结合很重要。未来，我们希望对这个160kDa的配体分子进行大规模纯化，确定其部分氨基酸序列，并进行cDNA克隆。