糖鎖を認識する白血球接着分子L-セレクチンの新しいリガンドの同定

L-选择素的新配体的鉴定，L-选择素是一种识别糖链的白细胞粘附分子

基本信息

批准号：
06770253
负责人：
川島博人
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770253/
关键词：
接着分子 L-セレクチンリンパ球ホ-ミング

项目摘要

生体内におけるリンパ球のホ-ミング現象は免疫系が秩序正しく機能を発揮するために必須の役割をしており、その特異性の少なくとも一部は白血球上の接着分子L-セレクチン(LECAM-1)が血管内皮細胞上の特定のリガンド分子と結合することにより担われる。私はラットL-セレクチンの細胞外ドメインとヒトIgG_1の定常領域ドメインを遺伝子操作によってつないだキメラ分子(LEC-IgG)をプローブとしてラットリンパ節におけるリガンドの解析を行った。はじめに、リンパ節の組織片のNP-40による可溶化物をWGA-カラムおよびLEC-IgG-カラムに順次かけ精製を進めた。得られた精製画分のSDS-PAGEの結果、160 kDaにほぼ単一なバンドが認められた。約100mgの精製の出発材料から2mgの精製標品が得られた。この分子はその分子量からこれまでに報告のない新たなL-セレクチンのリガンドであるものと考えられた。次に、この160kDaのリガンド分子をNa^<125>Iにより標識した後にL-セレクチンとの反応性を検討した。その結果、^<125>I-標識物はヒトIgG-ビーズには反応せずLEC-IgG-ビーズにのみ反応することよりL-セレクチンに特異的に結合するものと考えられた。また、EDTAおよびL-セレクチンのレクチンドメインに反応する中和抗体HRL1およびHRL3存在下においてL-セレクチンとの反応が阻害されることよりL-セレクチンのレクチンドメインを介して認識されるもの考えられた。非中和抗体HRL2およびHRL4はこのリガンド分子とL-セレクチンとの結合に影響を及ぼさなかった。また、L-セレクチンに結合することの知られているfucoi danやPPMEなどの多糖やsulfatideもこの分子のL-セレクチンとの結合を阻害した。また、このリガンド分子に糖鎖修飾を施した後にL-セレクチンとの反応性を検討したところ、N-グリカナーゼ消化ではわずかに反応性が弱くなるもののほとんど影響しなかったがO-結合型、N-結合型いずれの糖鎖をも切り出すことの知られているTFMS処理により、L-セレクチンとの反応性は完全に消失した。このことより、この分子上のO-結合型糖鎖がL-セレクチンとの結合に重要であるものと考えられた。今後この160kDaのリガンド分子の大量精製を行い、部分アミノ酸配列の決定およびcDNAクローニングを行いたいと考えている。

体内淋巴细胞托管以有序的方式发挥免疫系统的作用，至少部分地是通过在白细胞上与血管内皮细胞上特定的配体分子在白细胞上的粘附分子L-选择素（LECAM-1）结合来实现其特异性的。我使用嵌合分子（LEC-IGG）分析了大鼠淋巴结中的配体，该分子经过基因设计，用于将大鼠L-甲基蛋白的细胞外域与人IgG_1的恒定区域结合在一起。首先，将具有NP-40的淋巴结组织的裂解物依次应用于WGA-柱和LEC-IGG-POLMANTS以进行纯化。纯化的部分的SDS-PAGE表明，在160 kDa处发现了几乎一个频带。大约100毫克纯化的起始材料给出了2 mg纯化的制剂。由于其分子量，该分子被认为是迄今尚未报道的一种新的L-选择蛋白配体。接下来，该160 kDa配体分子用Na^<125> I标记，然后研究了与L-选择素的反应性。结果，人们认为 ^<125> i标记的产物特异性与L-选择蛋白结合，而不是对人IgG珠的反应，而不是对LEC-IGG珠珠的反应。此外，人们认为，在中和抗体的存在HRL1和HRL3的情况下，与L-选择素的反应受到了对EDTA和L-选择蛋白的凝集素域反应的反应，因此可能通过L-粘蛋白的凝集素结构域识别。非中和抗体HRL2和HRL4对该配体分子与L-选择素的结合没有影响。此外，已知与L-选择素结合的多糖（例如Fucoi DAN和PPME）也抑制了该分子与L-选择素的结合。此外，在对该配体分子施糖基化后，研究了L-选择素的反应性。尽管消化N-甘氨酸酶时的反应性略有弱，但其作用很小，但是众所周知，TFMS治疗可对O-和N连接的糖链进行消除，完全消失了。这表明该分子上的O连锁糖链对于与L-选择素结合很重要。我们想对此160 kDa配体分子进行大量纯化，确定部分氨基酸序列并在将来克隆cDNA。