糖脂質シアル酸転移酵素の単離精製

糖脂唾液酸转移酶的分离纯化

• 批准号: 06770095
• 负责人: 笠原 浩二
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770095/
• 关键词: ガングリオシドGM3; GM3合成酵素; 糖脂質シアル酸転移酵素

糖脂質シアル酸転移酵素は膜内在性の酵素であること、抽出した酵素が不安定であること、活性測定が繁雑であることなどから、精製の成功しているものは数少なく、その生化学的性質はあまり分かっていない。本研究では、簡便な糖脂質シアル酸転移酵素活性測定法を開発しそれを用いて、GM3合成酵素の単離精製を試みた。逆相薄層クロマトグラフィーとバイオイメージングアナライザーを組み合せた活性測定法で、これまで1日要していた活性測定が3-4時間程度で行なえるようになり、失活しやすい本酵素には有効であった。本方法を用い豚各臓器の比活性を測定したところ、顎下腺に豊富に含まれていることが分かり同臓器を精製材料に選んだ。抽出に用いる界面活性剤を検討したところ、Triton X-100で効率よく抽出できることが分かった。抽出した酵素を安定化する因子を検討したところ、10%グリセロールと1mMCDPが効果的であった。各種アフィニティークロマトグラフィーを検討したところ、陽イオン交換クロマトグラフィー(P11 Phosphocellulose)、色素アフィニティークロマトグラフィー(Blue Sepharose)、レクチンアフィニティークロマトグラフィー(ConA Sepharose)、基質固定化アフィニティークロマトグラフィー(LacCer column)で効果的に部分精製できることが分かり、比活性をそれぞれ約5、3、5、30倍上げることができた。酵素の性質を調べたところ、金属イオンは要求せず、至適pHは6、Km値はCMP-NeuAcが270μM、LacCerが19μMだった。

糖脂乙烯基转移酶是膜积分酶，提取的酶不稳定，活性测量很复杂，因此很少成功纯化，并且它们的生化特性却不众所周知。在这项研究中，我们开发了一种简单的方法，用于测量糖脂的活性，并尝试使用这种方法隔离和纯化GM3合酶。该活性测量方法结合了相反的相薄层色谱和生物成像分析仪，可以在大约3-4小时内进行活性测量，该酶对这种酶有效，这是有效的，该酶易于失活。使用此方法，测量了每个猪器官的特异性活性，并发现在下颌腺中很丰富，并选择器官作为纯化材料。当我们研究用于提取的表面活性剂时，我们发现Triton X-100可以有效提取。当检查稳定提取的酶的因素时，有效的10％甘油和1 MMCDP是有效的。 Various affinity chromatography were examined and it was found that partial purification could be effectively performed by cation exchange chromatography (P11 Phosphocellulose), dye affinity chromatography (Blue Sepharose), lectin affinity chromatography (ConA Sepharose), and substrate immobilized affinity chromatography (LacCer column), and the specific activity could be increased by approximately 5, 3, 5, and 30 times, respectively.当检查酶的性能时，不需要金属离子，最佳pH值为6，CMP-NEUAC的Km值为270μm，而鞋底为19μm。

项目成果

Nara,K.et al.: "Expression cloning of a CMP-NeuAc:NeuAcα2.3Galβ1,4Glcβ1,1'Cer α2.8-sialyltransterase(GD35ynthase)from human melanoma cells." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. 7952-7956 (1994)

Nara, K. 等人：“从人黑色素瘤细胞中表达克隆 CMP-NeuAc:NeuAcα2.3Galβ1,4Glcβ1,1Cer α2.8-唾液酸转移酶 (GD35ynthase)。” 91. 7952-7956 (1994)

笠原浩二: "BIOSCIENCE SERIES ストレス蛋白質-基礎と臨床" 中外医学社(永田和宏編), 266 (1994)

Koji Kasahara：“生物科学系列应激蛋白 - 基础和临床”Chugai Igakusha（由 Kazuhiro Nagata 编辑），266（1994）

笠原浩二: "バイオマニュアルUPシリーズ分子生物学研究のための培養細胞実験法" 羊土社(黒木登志夫、許南浩 千田和広編), 243 (1995)

笠原浩司：《生物手册 UP 系列分子生物学研究用培养细胞实验方法》《Yodosha》（黑木俊夫、小南浩、千田一弘编），243（1995）