アルツハイマー病脳に蓄積するPHFタウの胎児型、非胎児型異常リン酸化部位の同定

鉴定阿尔茨海默病大脑中积累的 PHF tau 异常胎儿和非胎儿磷酸化位点

• 批准号: 06780652
• 负责人: 長谷川 成人
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780652/
• 关键词: アルツハイマー病; PHF; タウ; リン酸化; プロリン指向性キナーゼ; 神経細胞死

アルツハイマー病患者脳に蓄積するPHFタウを精製し、これまで未同定であったtau1及びC末端領域の異常リン酸化部位を蛋白化学的に解析した。精製PHFタウをプロテアーゼ消化し、tau1、C末端領域のペプチド得た後、これらをさらに固定化トリプシン等で小断片化して逆相HPLCで展開した。この際に胎児型タウを同様の処理をして比較対照とすることにより、非胎児型の異常リン酸化ペプチドを区別した。PHFタウに特異的なピークに注目しながら、得られたすべてのピークについてアミノ酸配列分析、及びイオンスプレー質量分析を行ない、リン酸化部位を同定した。アミノ酸配列分析はペプチドをアルカリ条件下でエタンチオール処理し、リン酸化セリンをS-エチルシステインに変換して行なうことで、リン酸化セリンをポジティブシグナルとして検出した。その結果、ヒトタウの最も長い分子種の配列番号に従って198、199、202、208、210、214、396、400、404、409、412、413、422番目のセリン、及び212、217、403番目のトレオニンがリン酸化されていることが明らかとなった。これまで同定されていた3箇所を加えて合計19箇所の部位のリン酸化が同定されたことになるが、このうち11箇所の部位は胎児型タウにも検出される部位であった。それ以外の8箇所はPHFタウに特異的なリン酸化部位と考えられた。このような非胎児型のリン酸化部位はセリン/トレオニン-プロリンという配列をもつ、いわゆるプロリン指向性キナーゼの認識部位とそうでない部位があり、非胎児型の異常リン酸化にも複数のキナーゼが関与していることが示唆された。

我们纯化了在阿尔茨海默病患者大脑中积累的 PHF tau，并对 tau1 C 末端区域先前未识别的异常磷酸化位点进行了蛋白质化学分析。纯化的PHF tau用蛋白酶消化，得到tau1 C末端区域的肽，使用固定化胰蛋白酶等进一步裂解成小片段，并通过反相HPLC进行显色。此时，对胎儿tau进行同样的处理，并作为对照来区分非胎儿的异常磷酸化肽。以 PHF tau 特有的峰为中心，对所有获得的峰进行氨基酸序列分析和离子喷雾质谱分析，以鉴定磷酸化位点。在碱性条件下用乙硫醇处理肽，将磷酸化丝氨酸转化为S-乙基半胱氨酸，进行氨基酸序列分析，检测到磷酸化丝氨酸为阳性信号。结果，根据人tau最长分子种类的序列号，第198、199、202、208、210、214、396、400、404、409、412、413和422位点的丝氨酸，以及丝氨酸在位置212、217和403处，很明显苏氨酸被磷酸化。包括之前确定的三个位点，总共确定了 19 个磷酸化位点，其中 11 个位点也在胎儿 tau 中检测到。其他八个位点被认为是 PHF-tau 特异性磷酸化位点。这些非胎儿型磷酸化位点具有丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸序列，并且存在所谓的脯氨酸定向激酶的识别位点和不具有的位点，并且多种激酶参与异常非胎儿型磷酸化。有人建议