アルツハイマー病脳に蓄積するPHFタウの胎児型、非胎児型異常リン酸化部位の同定

鉴定阿尔茨海默病大脑中积累的 PHF tau 异常胎儿和非胎儿磷酸化位点

• 批准号: 06780652
• 负责人: 長谷川 成人
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780652/
• 关键词: アルツハイマー病; PHF; タウ; リン酸化; プロリン指向性キナーゼ; 神経細胞死

アルツハイマー病患者脳に蓄積するPHFタウを精製し、これまで未同定であったtau1及びC末端領域の異常リン酸化部位を蛋白化学的に解析した。精製PHFタウをプロテアーゼ消化し、tau1、C末端領域のペプチド得た後、これらをさらに固定化トリプシン等で小断片化して逆相HPLCで展開した。この際に胎児型タウを同様の処理をして比較対照とすることにより、非胎児型の異常リン酸化ペプチドを区別した。PHFタウに特異的なピークに注目しながら、得られたすべてのピークについてアミノ酸配列分析、及びイオンスプレー質量分析を行ない、リン酸化部位を同定した。アミノ酸配列分析はペプチドをアルカリ条件下でエタンチオール処理し、リン酸化セリンをS-エチルシステインに変換して行なうことで、リン酸化セリンをポジティブシグナルとして検出した。その結果、ヒトタウの最も長い分子種の配列番号に従って198、199、202、208、210、214、396、400、404、409、412、413、422番目のセリン、及び212、217、403番目のトレオニンがリン酸化されていることが明らかとなった。これまで同定されていた3箇所を加えて合計19箇所の部位のリン酸化が同定されたことになるが、このうち11箇所の部位は胎児型タウにも検出される部位であった。それ以外の8箇所はPHFタウに特異的なリン酸化部位と考えられた。このような非胎児型のリン酸化部位はセリン/トレオニン-プロリンという配列をもつ、いわゆるプロリン指向性キナーゼの認識部位とそうでない部位があり、非胎児型の異常リン酸化にも複数のキナーゼが関与していることが示唆された。

纯化了在阿尔茨海默氏病患者的大脑中积累的PHF tau，并在蛋白化学上分析了尚未鉴定出的Tau1和C末端区域的异常磷酸化位点。通过蛋白酶消化纯化的PHF tau，以在Tau1和C末端区域获得肽，然后用固定的胰蛋白酶或类似物将其进一步碎裂，并由反向相反的相HPLC开发。目前，胎儿TAU以相同的方式进行了比较和对照处理，并区分了非开发异常磷酸肽。对所获得的所有峰进行进行氨基酸序列分析和离子喷雾质量分析，以鉴定磷酸化位点，重点是PHF TAU特异性峰。氨基酸序列分析是通过在碱性条件下通过乙醇处理肽的，并将磷酸化的丝氨酸转化为S-乙基半胱氨酸的肽，从而将磷酸化的丝氨酸检测为正信号。结果表明，位置的丝氨酸在198、199、202、208、210、214、396、400、400、404、409、412、413和位于位置212、217和403处的丝氨酸是根据最长人类Tau物种的SEQ ID NOS磷酸化的。添加了先前确定的位点的三个位置，总共确定了19个位点的磷酸化，在这些位点中，在胎儿TAU中也检测到11个位点。其他八个地点被认为是针对PHF TAU的磷酸化位点。这样的非易经磷酸化位点包括识别和不识别具有丝氨酸/苏氨酸促磷酸序列的所谓脯氨酸指导激酶的位点，并建议多种激酶也参与非易发性形式的异常磷酸化。