神経変性疾患における異常リン酸化タウの蓄積機構の解明

阐明神经退行性疾病中异常磷酸化 tau 的积累机制

• 批准号: 13210032
• 负责人: 長谷川 成人
• 金额: $ 4.93万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13210032/
• 关键词: 脳神経疾患; 痴呆; 老化; プロテオーム; 蛋白質

(1)試験管内モデルFTDP-17のミスセンス変異(P301L、V337M、K257T、G389R)を導入したリコンビナントタウを大腸菌に発現、精製し、ヘパリン存在化でタウの線維形成を電子顕微鏡で観察したところ、変異を有するタウは野生型タウ(WT)よりも多くの線維形成がみられ、変異の線維形成促進効果が観察された。その効果はP301Lが最も大きかった。またタウをラット脳粗抽出液でリン酸化して線維化したところ、タウの線維形成の促進が観察された。ヘパリンを添加しない系においても線維形成までは時間がかかったが、同様の結果が得られた。線維化したタウを遠心後、上清と沈澱に分けて、線維化タウを定量したが、電子顕微鏡による観察とほぼ一致した結果が得られた。今回の実験から、タウの変異が線維化を促進することが確認されたと共に、リン酸化がタウの線維化を促進すること、リン酸化と変異の効果が相加的に働くことが試験管内のタウの線維化実験においてはじめて観察された。(2)動物モデル野生型ヒトタウ、及びFTDP-17のP301L、P301S変異を導入したタウを過剰発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製し、それぞれのタウがハエの脳内で発現していることを免疫組織染色で確認した。(3)Lewy小体に蓄積するα-synucleinのリン酸化の同定。Lewy小体型痴呆患者脳に蓄積しているα-synucleinを精製し、アミノ酸配列解析、質量分析を行ったところ、蓄積しているα-synucleinの129番目のセリンが高度にリン酸化されていることを発見した。リン酸化ペプチドを合成し特異的抗体を調製して免疫化学的解析をしたところ、正常では5%程度しかリン酸化されていないのに対し、蓄積しているものは90%以上リン酸化されていることを見出した。

(1)体外模型在大肠杆菌中表达并纯化含有FTDP-17错义突变(P301L、V337M、K257T、G389R)的重组tau，并在存在Tau的肝素的情况下使用电子显微镜观察tau原纤维的形成。该突变比野生型 tau (WT) 形成更多的原纤维，表明该突变促进了原纤维的形成。 P301L 的效果最大。此外，当用粗制大鼠脑提取物磷酸化tau以形成原纤维时，观察到tau原纤维形成的促进。尽管纤维形成需要更长的时间，但在没有肝素的系统中也获得了类似的结果。将纤维化的tau蛋白离心后，研究人员分离上清液和沉淀物，对纤维化的tau蛋白进行定量，结果与电子显微镜观察结果几乎一致。该实验证实了 tau 突变促进纤维化，磷酸化促进 tau 纤维颤动，并且磷酸化和突变的作用相加，这是在 tau 纤维颤动实验中首次观察到的。 (2)动物模型我们产生了过表达野生型人类tau和具有FTDP-17的P301L和P301S突变的tau的转基因果蝇，并通过免疫组织化学证实每种tau在果蝇脑中表达。 (3)路易体中积累的α-突触核蛋白磷酸化的鉴定。当纯化路易体痴呆患者大脑中积聚的α-突触核蛋白并进行氨基酸序列分析和质谱分析时，发现积聚的α-突触核蛋白的第129位丝氨酸高度磷酸化。当合成磷酸化肽、制备特异性抗体并进行免疫化学分析时，我发现，虽然正常细胞只有约5%被磷酸化，但积累的肽却有90%以上被磷酸化。

项目成果

Mori H, Motoi Y, Kobayashi T, Hasegawa M, et al: "Tau accumulation in a patient with pallidonigroluysian atrophy"Neurosci Lett. 309. 89-92 (2001)

Mori H、Motoi Y、Kobayashi T、Hasekawa M 等人：“苍白球卢伊萎缩患者中的 Tau 积累”Neurosci Lett。

Hasegawa M, Fujiwara H, Domae N, et al.: "α-synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions"Nature Cell Biology. 4. 160-164 (2002)

Hasekawa M、Fujiwara H、Domae N 等人：“α-突触核蛋白在突触核蛋白病病变中被磷酸化”《自然细胞生物学》4. 160-164 (2002)。

Kuzuhara S, Kokubo Y, Sasaki R, Narita Y, Yabana T, Hasegawa M et al.: "Familial amyotrophic lateral sclerosis and parkinsonism-dementia complex of the Kii Peninsula of Japan : clinical and neuropathological study and tau analysis"Ann Neurol. 49. 501-11 (

Kuzuhara S、Kokubo Y、Sasaki R、Narita Y、Yabana T、Hasekawa M 等人：“日本纪伊半岛的家族性肌萎缩侧索硬化症和帕金森痴呆症复合体：临床和神经病理学研究以及 tau 分析”Ann Neurol。

Miyamoto K, Kowalska A, Hasegawa M et al: "Familial frontotemporal dementia and parkinsonism with a novel mutation at an intron 10+11-splice site in the tau gene"Ann Neurol. 50. 117-20 (2001)

Miyamoto K、Kowalska A、Hasekawa M 等人：“家族性额颞叶痴呆和帕金森病，tau 基因内含子 10 11 剪接位点出现新突变”Ann Neurol。