神経変性疾患における異常リン酸化タウの蓄積機構の解明

阐明神经退行性疾病中异常磷酸化 tau 的积累机制

• 批准号: 13210032
• 负责人: 長谷川 成人
• 金额: $ 4.93万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13210032/
• 关键词: 脳神経疾患; 痴呆; 老化; プロテオーム; 蛋白質

(1)試験管内モデルFTDP-17のミスセンス変異(P301L、V337M、K257T、G389R)を導入したリコンビナントタウを大腸菌に発現、精製し、ヘパリン存在化でタウの線維形成を電子顕微鏡で観察したところ、変異を有するタウは野生型タウ(WT)よりも多くの線維形成がみられ、変異の線維形成促進効果が観察された。その効果はP301Lが最も大きかった。またタウをラット脳粗抽出液でリン酸化して線維化したところ、タウの線維形成の促進が観察された。ヘパリンを添加しない系においても線維形成までは時間がかかったが、同様の結果が得られた。線維化したタウを遠心後、上清と沈澱に分けて、線維化タウを定量したが、電子顕微鏡による観察とほぼ一致した結果が得られた。今回の実験から、タウの変異が線維化を促進することが確認されたと共に、リン酸化がタウの線維化を促進すること、リン酸化と変異の効果が相加的に働くことが試験管内のタウの線維化実験においてはじめて観察された。(2)動物モデル野生型ヒトタウ、及びFTDP-17のP301L、P301S変異を導入したタウを過剰発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製し、それぞれのタウがハエの脳内で発現していることを免疫組織染色で確認した。(3)Lewy小体に蓄積するα-synucleinのリン酸化の同定。Lewy小体型痴呆患者脳に蓄積しているα-synucleinを精製し、アミノ酸配列解析、質量分析を行ったところ、蓄積しているα-synucleinの129番目のセリンが高度にリン酸化されていることを発見した。リン酸化ペプチドを合成し特異的抗体を調製して免疫化学的解析をしたところ、正常では5%程度しかリン酸化されていないのに対し、蓄積しているものは90%以上リン酸化されていることを見出した。

(1) Recombinant tau, which had been introduced with missense mutations (P301L, V337M, K257T, G389R) in vitro model FTDP-17, was expressed and purified in E. coli, and when tau fibril formation was observed under an electron microscope when heparin was present, tau with mutations showed more fibril formation than wild-type tau (WT), and观察到突变的促纤维形成。 P301L是最大的效果。此外，将tau用大鼠粗脑提取物磷酸化至纤维化，并观察到促进了tau纤维化。尽管即使在没有肝素添加的系统中，纤维化也花了很长时间才形成，但获得了类似的结果。将纤维化tau离心，然后分为上清液和沉淀以量化纤维化tau，并获得了与电子显微镜观察的结果几乎一致的结果。该实验证实了tau突变会促进纤维化，并且在体外的tau纤维化实验中首先观察到磷酸化促进tau纤维化，并且磷酸化及突变的作用加上起作用。 （2）产生了在FTDP-17中引入P301L和P301S突变的过表达动物模型的转基因果蝇模型野生型野生型人Tau，并产生了免疫组织化学染色，证实了每个TAU在苍蝇的大脑中表达。 （3）鉴定在路易体中积累的α-突触核蛋白的磷酸化。纯化了在路易体体内痴呆症患者大脑中积聚的α-突触核蛋白，进行了氨基酸序列分析和质量分析，并发现α-核蛋白第129位的累积丝氨酸高度磷酸化。当合成磷酸肽并制备特定抗体时，进行了免疫化学分析，发现虽然正常，但仅约5％的磷酸化，但累积物质的磷酸化超过90％。

项目成果

Mori H, Motoi Y, Kobayashi T, Hasegawa M, et al: "Tau accumulation in a patient with pallidonigroluysian atrophy"Neurosci Lett. 309. 89-92 (2001)

Mori H、Motoi Y、Kobayashi T、Hasekawa M 等人：“苍白球卢伊萎缩患者中的 Tau 积累”Neurosci Lett。

Hasegawa M, Fujiwara H, Domae N, et al.: "α-synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions"Nature Cell Biology. 4. 160-164 (2002)

Hasekawa M、Fujiwara H、Domae N 等人：“α-突触核蛋白在突触核蛋白病病变中被磷酸化”《自然细胞生物学》4. 160-164 (2002)。

Kuzuhara S, Kokubo Y, Sasaki R, Narita Y, Yabana T, Hasegawa M et al.: "Familial amyotrophic lateral sclerosis and parkinsonism-dementia complex of the Kii Peninsula of Japan : clinical and neuropathological study and tau analysis"Ann Neurol. 49. 501-11 (

Kuzuhara S、Kokubo Y、Sasaki R、Narita Y、Yabana T、Hasekawa M 等人：“日本纪伊半岛的家族性肌萎缩侧索硬化症和帕金森痴呆症复合体：临床和神经病理学研究以及 tau 分析”Ann Neurol。

Miyamoto K, Kowalska A, Hasegawa M et al: "Familial frontotemporal dementia and parkinsonism with a novel mutation at an intron 10+11-splice site in the tau gene"Ann Neurol. 50. 117-20 (2001)

Miyamoto K、Kowalska A、Hasekawa M 等人：“家族性额颞叶痴呆和帕金森病，tau 基因内含子 10 11 剪接位点出现新突变”Ann Neurol。