ラットインスリン様成長因子I遺伝子3'非翻訳領域の構造・機能の解析

大鼠胰岛素样生长因子I基因3非翻译区结构与功能分析

基本信息

批准号：
05760105
负责人：
竹中麻子
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

IGF-I遺伝子の転写は、5'上流領域のエクソン1あるいはエクソン2に存在するいずれかの転写開始点を利用する、3'下流領域のエクソン6に点在する異なるpolyA付加シグナルを選択的に利用するなど様々に制御され、複数種のmRNAが生成することが知られている。本研究では、従来のNorthern blot分析に加え、感度および定量性の優れたRNase protection assayを用いて、タンパク質栄養条件に応答したIGF-ImRNA生成機構を詳細に検討することを目的とした。まず、3'下流領域のpolyA付加シグナルの利用状態を詳細に追跡するため、IGF-I coding regionを含むcDNAおよび最初のpolyA付加シグナル直後の3'下流領域の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをプローブとして、ラット肝臓のRNAを用いてNorthern blot分析を行なった。その結果、cDNAを用いた場合には、0.8-1.2kbのbroadなバンドおよび2.0,3.6,4.0,7.4kbの複数種の転写産物が観察されたが、オリゴヌクレオチドを用いた場合には、0.8-1.2kbのバンドのみが検出されなかった。この結果は、0.8-1.2kbのIGF-mRNAは最初のpolyA付加シグナルを利用して生成し、したがって主にIGF-ImRNAの長さは3'非翻訳領域の長さにより決まっていることを示している。続いて、タンパク質栄養条件の異なるラット肝臓におけるIGF-ImRNA量をNorthern blot分析により測定したところ、タンパク質栄養状態の悪化により特に7.4kbのIGF-ImRNAの減少が著しいことが明らかとなった。我々の他の結果も併せると、タンパク質栄養状態は主に長いIGF-ImRNAの安定性に大きく影響していると考えられた。さらに、エクソン6に10箇所程度存在するpolyA付加シグナルをそれぞれ含むcDNA断片をPCRにより調製することに成功したので、現在、RNase protection assayによる定量的な解析を行なっている。

已知IGF-I基因的转录以各种方式进行控制，例如利用在5'上游区域中5'上游区域中存在于外显子1或2外显子2中存在的转录起始点，或者选择性地利用3'下游区域中散布在外显子6中的外显子6中的不同polya添加信号，以及生成多种类型的MRNA。在这项研究中，我们旨在详细研究IGF-IMRNA产生的机理，以响应蛋白质营养条件，并使用具有出色敏感性和定量特性的RNase保护测定法进行了常规的Northern印迹分析。首先，为了密切跟踪在3'下游区域中Polya添加信号的使用状态，使用含有IGF-1编码区域的cDNA和一个寡核苷酸，在第一个Polya添加信号后立即使用3'下游区域的基本序列，使用大鼠肝脏RNA进行北印迹分析。结果，当使用cDNA时，观察到0.8-1.2kb的宽带和2.0、3.6、4.0和7.4kb的多个转录本被观察到，但是当使用寡核苷酸时，仅检测到0.8-1.2kb的频段。结果表明，使用初始Polya添加信号生成0.8-1.2 Kb IGF-MRNA，因此IGF-IMRNA的长度主要取决于3'未翻译区域的长度。接下来，当通过Northern印迹分析测量具有不同蛋白质营养条件的大鼠肝脏中的IGF-IMRNA水平时，发现蛋白质营养状况的恶化导致IGF-IMRNA显着降低IGF-IMRNA，尤其是在7.4 kb时。加上我们的其他结果，蛋白质营养状况被认为对长IGF-INRNA的稳定性产生了重大影响。此外，我们已经成功制定了包含PCR外显子6中存在的每种polya添加信号的cDNA片段，目前正在使用RNase保护测定法进行定量分析。