アミノ酸に応答した遺伝子転写制御機構の解析

氨基酸响应的基因转录调控机制分析

基本信息

批准号：
09760125
负责人：
竹中麻子
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760125/
关键词：
アミノ酸転写制御 IGFBP-1 タンパク質栄養転写調節 IRE GRE HuH-7

项目摘要

本研究では、アミノ酸に応答して遺伝子の転写が制御されるメカニズムを解明することを目的として、インスリン様成長因子結合タンパク質-1(IGFBP-1)遺伝子をモデルとして研究を進めている。平成9年度の研究で、アミノ酸欠乏に応答してIGFBP-1遺伝子の転写を誘導するのに必要な約35bpのアミノ酸応答性領域(AARE)を、IGFBP-1遺伝子5'領域に同定することができた。そこで本年度は、IGFBP-1遺伝子と相互作用する転写制御因子のIGFBP-1遺伝子との結合量や結合状態が、アミノ酸欠乏に応答して変動するかどうかをgelshift assayおよびDNaseI footprinting等の方法により検討した。AAREを含むIGFBP-1遺伝子5'領域約1000bpを、制限酵素で100〜250bp程度の断片とし、これらをプローブとしてgel shift assayにより結合因子の検出を行った。このとき、核抽出液として通常食あるいはアミノ酸除去食を摂取したラット肝臓由来のもの、および通常培地あるいはアミノ酸除去培地中で培養した肝癌由来細胞株H4ILE由来のものを用いて、アミノ酸除去による結合因子の挙動の変化を合わせて検討した。IGFBP-1遺伝子の-902〜-812、-812〜-688、-688〜-582、-582〜-450、-450〜-274、-274〜-70、-70〜+114のそれぞれの領域をプローブとしてgel shift assayを行ったところ、-688〜-582、-274〜-70、-70〜+114の3つのフラグメントを用いた際に結合する核内因子が検出された。AAREは-274〜-70、-70〜+ll4の2領域に一部重なって存在することから、AAREを含む253bpのプローブも作成して同様にassayしたところ、結合する因子の存在が確認された。また特異的抗体を用いた実験から、-70〜+114領域に結合する因子は肝臓特異的転写因子の一つであるHNF-1と同定された。しかしながら、アミノ酸除去によりDNAとの結合量・結合状態状態に変化がみられた因子はみられなかった。また、DNaseI footprintingにおいても、結合領域にアミノ酸除去の影響がみられた因子はなかった。

在这项研究中，我们使用胰岛素样生长因子结合蛋白-1 (IGFBP-1) 基因作为模型来阐明基因转录响应氨基酸的调节机制。 1997 年进行的研究在 IGFBP-1 基因的 5' 区域发现了一个大约 35 bp 的氨基酸响应区 (AARE)，它是诱导 IGFBP-1 基因转录以响应氨基酸饥饿所必需的。去做它。因此，今年，我们将使用凝胶迁移分析和 DNaseI 足迹等方法来研究与 IGFBP-1 基因相互作用的转录调节因子的结合量和结合状态是否会因氨基酸缺乏而发生变化。使用限制性内切酶将包含AARE的IGFBP-1基因的5’区域的约1000bp制成约100至250bp的片段，并使用这些片段作为探针通过凝胶位移测定法检测结合因子。此时，来自正常饮食或氨基酸耗尽饮食的大鼠肝脏的核提取物，以及来自在正常培养基或氨基酸耗尽培养基中培养的肝癌细胞系H4ILE的核提取物用于通过去除氨基酸来检测结合因子我们还检查了行为的变化。 IGFBP-1 基因凝胶位移的-902至-812、-812至-688、-688至-582、-582至-450、-450至-274、-274至-70、-70至+114区域一个探针测定时，使用三个片段-688至-582、-274至-70和-70至+114检测核因子结合。由于AARE存在于-274至-70和-70至+114两个区域中，这两个区域部分重叠，因此也制作了含有AARE的253bp探针并以相同的方式进行测定，并确认了结合因子的存在。此外，使用特异性抗体的实验表明，与-70至+114区域结合的因子被鉴定为HNF-1，一种肝脏特异性转录因子。然而，没有发现因氨基酸去除而导致与DNA的结合量或结合状态发生变化的因子。此外，在 DNaseI 足迹分析中，没有发现任何因素受到结合区域氨基酸去除的影响。