精製標品を用いた再構成系による大腸菌蛋白質膜透過の分子機構

使用纯化制剂重构系统进行大肠杆菌蛋白膜渗透的分子机制

基本信息

批准号：
03680164
负责人：
徳田元
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03680164/
关键词：
蛋白質膜透過再構成系大腸菌 SecA SecE SecY

项目摘要

大腸菌の蛋白質膜透過には、SecA、SecB、SecE、SecD、SecF、SecY等の蛋白質因子が関与しているとされている。この内SecB蛋白質は、膜透過に必須ではない。一方、SecA蛋白質は膜表在性のATP分解活性を持つ必須因子である。SecD、SecE、SecF、SecY蛋白質は膜内在性の蛋白質であり、これらの機能を明らかにするためには、リポゾ-ムを用いた再構成実験系が必須である。申請者は、既にこの再構成実験系を確立し報告した。さらにSecEとSecY蛋白質をはじめて均一に迄精製することに成功し、これらを用いた本年度の研究で以下の成果を得た。(1)SecE、SecYは、いずれも必須の因子であることを精製標品を用いた再構成系がはじめて証明した。(2)SecE、SecY、SecAのみで大腸菌の蛋白質膜透過系が構築できることを明らかにした。(3)SecA蛋白質は、リポゾ-ム、前駆体蛋白質、ATP等と相互作用すると構造変化を起こすことを示した。(4)SecE蛋白質は、3カ所の膜貫通領域を持つ蛋白質である。3番目の膜貫通領域のみからなる変異SecEが機能的であることが遺伝学的に示唆されている。申請者らは、遺伝子工学的手法を用いて作成した変異SecE蛋白質を精製し、再構成を用いて、SecEの機能は3番目の膜貫通領域に集中していることを明らかにした。またこの領域がSecYと相互作用することを示した。(5)成熟体部分に電荷を持たない蛋白質の膜透過も、プロトン駆動力要求性であることを示し、蛋白質の電気泳動的移動にプロトン駆動力が必要になるのではなく、膜透過系自体がプロトン駆動力を要求することを示した。(6)蛋白質膜透過系は蛋白質/H^+アンチポ-タ-様の活性を有することを見いだした。(5)、(6)は反転膜小胞を用いて得られた結果であり、現在これらの知見を再構成系でより詳細に解析している。

SecA、SecB、SecE、SecD、SecF 和 SecY 等蛋白质因子据说与大肠杆菌的蛋白质膜渗透有关。其中，SecB 蛋白对于膜渗透不是必需的。另一方面，SecA蛋白是具有膜表面ATP降解活性的必需因子。 SecD、SecE、SecF 和 SecY 蛋白是完整的膜蛋白，使用脂质体的重构实验系统对于阐明其功能至关重要。申请人已经建立并报告了该重组实验系统。此外，我们首次成功地将 SecE 和 SecY 蛋白纯化至同质，今年使用这些蛋白的研究获得了以下结果。 (1) 我们首次使用纯化样品的重构系统证明了 SecE 和 SecY 是重要因素。 (2)表明仅使用SecE、SecY和SecA就可以构建大肠杆菌蛋白膜渗透系统。 (3)研究表明SecA蛋白与脂质体、前体蛋白、ATP等相互作用时会发生结构变化。 (4)SecE蛋白是具有3个跨膜区的蛋白。遗传证据表明仅由第三跨膜区组成的突变体 SecE 具有功能。申请人纯化了利用基因工程技术产生的突变型SecE蛋白，并通过重构揭示了SecE的功能集中在第三跨膜区。我们还表明该区域与 SecY 相互作用。 (5)成熟部分不带电荷的蛋白质的膜渗透也需要质子动力，表明蛋白质的电泳运动不需要质子动力，而是膜渗透系统本身需要质子动力动力。 (6)发现蛋白质膜渗透系统具有蛋白质/H^+逆向转运蛋白样活性。 (5) 和 (6) 是使用倒置膜囊泡获得的结果，我们目前正在使用重构系统更详细地分析这些结果。