精製標品を用いた再構成系による大腸菌蛋白質膜透過の分子機構

使用纯化制剂重构系统进行大肠杆菌蛋白膜渗透的分子机制

基本信息

批准号：
03680164
负责人：
徳田元
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03680164/
关键词：
蛋白質膜透過再構成系大腸菌 SecA SecE SecY

项目摘要

大腸菌の蛋白質膜透過には、SecA、SecB、SecE、SecD、SecF、SecY等の蛋白質因子が関与しているとされている。この内SecB蛋白質は、膜透過に必須ではない。一方、SecA蛋白質は膜表在性のATP分解活性を持つ必須因子である。SecD、SecE、SecF、SecY蛋白質は膜内在性の蛋白質であり、これらの機能を明らかにするためには、リポゾ-ムを用いた再構成実験系が必須である。申請者は、既にこの再構成実験系を確立し報告した。さらにSecEとSecY蛋白質をはじめて均一に迄精製することに成功し、これらを用いた本年度の研究で以下の成果を得た。(1)SecE、SecYは、いずれも必須の因子であることを精製標品を用いた再構成系がはじめて証明した。(2)SecE、SecY、SecAのみで大腸菌の蛋白質膜透過系が構築できることを明らかにした。(3)SecA蛋白質は、リポゾ-ム、前駆体蛋白質、ATP等と相互作用すると構造変化を起こすことを示した。(4)SecE蛋白質は、3カ所の膜貫通領域を持つ蛋白質である。3番目の膜貫通領域のみからなる変異SecEが機能的であることが遺伝学的に示唆されている。申請者らは、遺伝子工学的手法を用いて作成した変異SecE蛋白質を精製し、再構成を用いて、SecEの機能は3番目の膜貫通領域に集中していることを明らかにした。またこの領域がSecYと相互作用することを示した。(5)成熟体部分に電荷を持たない蛋白質の膜透過も、プロトン駆動力要求性であることを示し、蛋白質の電気泳動的移動にプロトン駆動力が必要になるのではなく、膜透過系自体がプロトン駆動力を要求することを示した。(6)蛋白質膜透過系は蛋白質/H^+アンチポ-タ-様の活性を有することを見いだした。(5)、(6)は反転膜小胞を用いて得られた結果であり、現在これらの知見を再構成系でより詳細に解析している。

据说蛋白质因子，例如SECA，SECB，SECD，SECD，SECF，SECY等，涉及大肠杆菌中的蛋白质膜渗透。其中，SECB蛋白对于膜渗透不是必不可少的。另一方面，SECA蛋白是膜存在的ATP降解活性的重要因素。 SECD，SECE，SECF和SECY蛋白是内源性蛋白，为了阐明其功能，使用脂质体的重建实验至关重要。申请人已经建立并报告了这种重建实验系统。此外，我们首次成功地将SECE和SECY蛋白纯化为均匀性，并从今年的研究中获得了以下结果。（1）首次使用纯化制剂的重建系统证明，Sece和Secy都是基本因素。（2）已经揭示了大肠杆菌的蛋白质膜通透性系统可以仅使用SECE，SECY和SECA构建。（3）已经表明，与脂质体，前体蛋白，ATP等相互作用时，SECA蛋白会发生结构变化。（4）SECE蛋白是一种具有三个跨膜区域的蛋白。从遗传上提出，仅由第三个跨膜区域组成的突变体SECE具有功能性。申请人使用基因工程技术创建的纯化突变体Sece蛋白，并使用重排来表明SECE功能集中在第三个跨膜区域。还表明该区域与Secy相互作用。（5）在成熟身体部位没有电荷的蛋白质的膜渗透也需要质子驱动力，这表明蛋白质的电泳运动不需要质子驱动力，但是膜渗透系统本身需要质子驱动力。（6）发现蛋白质膜渗透系统具有蛋白质/h^+抗细胞样活性。（5）和（6）是使用倒膜囊泡获得的结果，目前正在使用重建系统对这些发现进行更详细的分析。