非大腸菌タンパク質生産系を併用したモジュラーポリケチド合成酵素の試験管内再構成

使用非大肠杆菌蛋白质生产系统体外重构模块化聚酮合酶。

基本信息

批准号：
21K05404
负责人：
湯澤賢
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

モジュラーポリケチド合成酵素（モジュラーPKS）は多様な薬剤の基本骨格の生合成を担う巨大酵素である。モジュラーPKSの生化学的解析や構造生物学的解析は新規薬剤の創出につながる可能性があるため、過去20年に渡り研究が行われている領域である。モジュラーPKSはその大きさ故、野生型酵素のin vitro解析は容易ではなく、これまで試験管内再構成を達成した例は世界でまだ1例しかなく、至適温度、至適pH、至適イオン強度、kcat、KM等の基本的な情報が一般にどんな分布を示すかは明らかになっていない。本研究では、これまで利用されていない非大腸菌タンパク質生産系も併用し、新たに数種類の野生型モジュラーPKSの試験管内再構成およびそれらの生化学的解析を実施することを目的としている。第一のモジュラーPKSに関しては、非大腸菌タンパク質生産系を併用することで試験管内再構成にすでに成功している。現在は引き続き、至適温度、至適pH、至適イオン強度、kcat、KM等の解析を進めている。本成果は未発表であるが、世界で2例目の野生型酵素の試験管内再構成の成功例になり得る。また国内では初の成果となり得る。第二のモジュラーPKSに関しては、プラスミド構築に苦戦しており、まだタンパク質精製の段階に至っていない。初年度の実施報告で述べた第三の系に関して2年目は精力的に研究を進めた。この第三の系は、モジュラーPKSと非リボソーム型ペプチド合成酵素とのハイブリッドの系である。第三の系では計10種類の酵素が再構成には必要であり、これまで７種類に関しては大腸菌を用いたタンパク質生産系で得ることに成功している。一方で残りの３種類に関しては大腸菌ではごく少量のみ、あるいは全く生産されないケースもあった。現在は我々が保有する非大腸菌タンパク質生産系を活用して、残り数種類の酵素の生産を試みている段階である。

模块化聚酮合酶（modular PKS）是一种负责多种药物基本骨架生物合成的大型酶。模块化 PKS 的生化和结构生物学分析有可能促进新药的开发，并且在过去 20 年一直是一个研究领域。由于模块化PKS的体积较大，很难在体外对野生型酶进行分析，迄今为止，国际上只有一个实现了体外重构的例子，尚不清楚其分布的基本信息。如强度、kcat、KM一般显示。在这项研究中，我们的目标是使用迄今为止尚未使用的非大肠杆菌蛋白质生产系统在体外重建几种新型野生型模块化 PKS 并进行生化分析。第一个模块化 PKS 已使用非大肠杆菌蛋白质生产系统在体外成功重建。目前，我们正在继续分析最佳温度、最佳pH、最佳离子强度、kcat、KM等。尽管这一结果尚未发表，但这可能是世界上第二个体外重构野生型酶的成功例子。这在日本也可能是首次。关于第二个模块化PKS，我们在构建质粒方面遇到困难，尚未达到蛋白质纯化阶段。第二年，我们积极开展第一年实施报告中提到的第三个制度的研究。第三个系统是模块化 PKS 和非核糖体肽合成酶的混合系统。在第三个系统中，重构需要总共10种酶，到目前为止，利用大肠杆菌的蛋白质生产系统已经成功获得了7种酶。另一方面，大肠杆菌仅产生少量的其余三种类型，或者在某些情况下根本不产生。我们目前正处于尝试使用我们的非大肠杆菌蛋白质生产系统生产剩余的几种酶的阶段。