再構成系による大腸菌蛋白質膜透過系の分子機構の解析

利用重构系统分析大肠杆菌蛋白膜渗透系统的分子机制

基本信息

批准号：
04680183
负责人：
徳田元
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌の蛋白質膜透過系は、精製したSecA、SecEおよびSecYから再構成できることを明らかにしている。この再構成系を用い、膜透過系の構造と機能について以下の点を明らかにした。1.必須因子である膜内在性SecEは、分子量約14,000の比較的小さい蛋白質であり、3箇所の膜貫通領域を持つと考えられている。遺伝子工学的手法によって、3番目の膜貫通領域のみからなる欠失SecEを作製し、これを大量発現させた大腸菌から精製した。再構成系によって、欠失SecEが正常SecEに匹敵する活性を有していることを明らかにした。また、欠失SecEはSecYと相互作用することも示した。SecEの機能は、C-末端領域の膜貫通部分に集中して存在することが明らかとなった。欠失SecEは、分子量が約6,000の低分子でありながらなお必須因子として機能する。この蛋白質の構造と機能の詳細を更に検討している。2.再構成活性は反転膜小胞の活性に比べ低いが、大腸菌の細胞質膜には、再構成活性を著しく促進する因子が存在することを見いだした。この因子を膜から可溶化し、均一に精製した。精製因子をSecEやSecYと共にプロテオリポゾームに再構成すると、膜透過活性が20倍以上促進された。部分アミノ酸配列を決定した結果、新因子であることが判明しSecGと命名した。またこの因子の構造遺伝子の一部と思われるDNA配列が、データベース検索の結果明らかとなった。現在この遺伝子のクローニングを行っている。SecG変異株の作製、SecG大量発現系の構築、SecGの精製ならびにその役割の生化学的解明等、今後一層新たな展開が期待できる。

大肠杆菌的蛋白质过滤系统可以通过精制的SECA，SECE和SECY重建。使用此重构系统阐明了膜 - 渗透性的结构和功能的以下几点。 1。基本因素是基本因素，是一种相对较小的蛋白质，分子量约为14,000，被认为具有三种膜穿透。基因工程方法是由仅由第三个膜穿透区组成的缺失SECE创建的，并从大肠杆菌中纯化，该大肠杆菌表示大量。重建系统表明，删除SECE与正常的SECE相当。删除的SECE还表示它与Secy相互作用。据表明，SECE的功能集中在C-einal区域的半公路上。即使分子量约为6,000个低分子，丢失的SECE也是重要因素。进一步研究了该蛋白质的结构和功能的细节。 2。重建活性低于反向膜活性的重建活性，但发现大肠杆菌细胞膜中有一些因素可显着促进重新连接活性。该因素是从膜上求解的，并均匀地完善。当将精制因子与Sece和Secy一起重建为蛋白质po，膜渗透活性被促进了20次以上。由于确定部分氨基酸序列，发现它是一个新因素，并被称为secg。 DNA序列似乎是该因素的结构基因的一部分，由于数据库搜索而被揭示。目前进行此基因克隆。我们可以期望将来会有更多的新发展，例如SECG突变股的生产，SECG质量表达系统的构建，SECG的完善以及阐明其角色的作用。