ラノステロ-ルの生合成研究

羊毛甾醇生物合成研究

• 批准号: 03670992
• 负责人: 海老塚 豊
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03670992/
• 关键词: ラノステロ-ル; オキシドスクアレン; ラット肝; 閉環酵素; コレステロ-ル

1.まず高比放射活性の ^3Hーオキシドスクアレンを化学合成し、閉環生成物であるラノステロ-ルの分離に逆相HPLCを導入することにより、簡便かつ高感度な生成物特異的アッッセイ法を確立した。2.コレスチラミン投与ラットの肝臓ミクロソ-ム画分に、ラノステロ-ル閉環活性を検出した。各種界面活性剤による可溶化を検討し、0.2%TritonXー100処理により効率良く可溶化することができた。また、可溶化酵素は、バッファ-に20%glycerol,1mM EDTAおよび1mM DTTを添加することにより比較的安定に取り扱えることを見出だした。3.ミクロソ-ム可溶化タンパクをHydroxylapatite,Isoelectric forcusing,Qーsepharose,高速ゲル濾過のカラムクロマトグラフィ-を組み合わせることにより、精製倍率1860倍、回収率28%でSDSーPAGE上単一なバンドとして精製することに成功した。4.精製酵素は、分子量75kDのサブユニットからなるhomodimerであり、等電点5.5,至適pH6.5ー8.0,基質に対するKm値55μMであった。アッセイバッファ-へのTritonXー100添加により約5倍活性化され、高塩濃度下で阻害を受けるなど、ブタ肝あるいは高等植物由来の閉環酵素とはかなり異なる性質を示した。5.精製酵素をLysーCで消化し、逆相HPLCにより2種のペプチドを単離した。アミノ酸配列分析の結果、このうちの1種ーAーHーEーFーLーRーLーSーQーVーTーDーNーNーPーDーYーQーKーはデ-タベ-スに見当たらないシ-クエンスであり、本酵素をコ-ドする遺伝子のクロ-ニングに際して用いるプロ-ブとして利用できる。以上のように、従来精製困難とされていたステロ-ル生合成における鍵酵素の精製に成功し、その性状を明らかにした。本研究の成果は、今後の活性部位探索研究を進める上で大きなステップとなるものである。

1。首先，通过化学合成的 ^3H-氧化喹啉具有高特异性放射性活性，并引入反向相位的HPLC来分离环形锁定的产品瘤含量，从而确定了一种简单且敏感的特异性测定方法。 2。在用胆碱胺治疗的大鼠的肝微粒体分数中检测到羊毛醇环闭合活性。研究了用各种表面活性剂溶解化，并通过使用0.2％Tritonx-100处理有效地实现了溶解化。还发现，可以通过在缓冲液中添加20％甘油，1 mM EDTA和1 mM DTT来相对稳定地处理溶解酶。 3。通过将微剥离蛋白与羟基磷灰石，等电的驱动，Q-塞磷脂和高速凝胶过滤柱色谱法结合，我们成功将其纯化为SDS-PAGE的单个频段，其纯化放大率为1860次，回收率为28％。 4。纯化的酶是一种同型二聚体，由分子量为75 kD的亚基组成，同级含量为5.5，最佳pH值为6.5-8.0，对于底物的pH值为6.5-8.0，km值为55μm。在测定缓冲液中添加TRITONX-100与源自猪肝或更高植物的闭环酶的特性显着不同，例如高盐浓度下的大约五倍的激活和抑制作用。 5。用LYS-C消化纯化的酶，并通过反向相HPLC分离两个肽。由于氨基酸序列分析，其中一种类型-A-H-E-F-L-LS-LS-Q-v-v-t-d-n-n-p-y-q-k-是在数据库中未发现的序列，可以用作在编码该酶的基因的克隆中使用的探针。如上所述，以前被认为难以纯化的固醇生物合成中关键酶的纯化已成功揭示。这项研究的结果是对现场搜索的未来研究的重要一步。

项目成果

M.Kusano: "Inhibition of solubilized squaleneー2,3ーepoxide:lanosterol cyclase by substrate analogues." Chem.Pharm.Bull.

M.Kusano：“底物类似物对溶解的角鲨烯-2,3-环氧化物：羊毛甾醇环化酶的抑制。”

M.Kusano: "Purification and some properties of squaleneー2,3ーepoxide:lanosterol cyclase from rat liver." Chem.Pharm.Bull.39. 239-241 (1991)

M.Kusano：“来自大鼠肝脏的角鲨烯-2,3-环氧化物：羊毛甾醇环化酶的纯化和一些特性。”Chem.Pharm.Bull.39（1991）。