薬用植物組織培養系におけるサポニンの生合成研究

药用植物组织培养体系中皂苷生物合成研究

• 批准号: 08877312
• 负责人: 海老塚 豊
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877312/
• 关键词: サポニン; 生合成; 薬用植物; 組織培養; オキシドスクワレン; ステロイド; トリテルペン; 酵素

生合成酵素の検出、特性化、遺伝子クローニングによりサポニン生合成にアプローチした。1.オタネニンジン毛状根においては、(1)毛状根培養系におけるサポニン生産の経時変化を検討し、まずオレアナン骨格を持つginsenoside-Roが生産され、これが減少し始める頃からダンマラン系サポニン生産が上昇するという興味ある事実を見いだした。(2)ついでオキシドスクアレン閉環酵素の検出、閉環産物の同定を試み、毛状根ミクロソーム画分に、ダンマレンジオール、β-アミリンおよびサイクロア-テノールの3種の閉環酵素活性を検出した。生成物のHPLC分析からダンマレンジオールは天然サポニンと同様20-Sの絶対配置を持つことを証明した。(3)3種の閉環活性のうち、ダンマレンジオール合成酵素活性は他の2種あるいは他の生物種で報告されている閉環酵素とは異なり、最大活性に界面活性剤の添加を必要としまいことまた至適pHが酸性側にある点など特徴ある性質を示すことを明らかにした。2.ホザキアヤメのシュート培養系では、(1)フロスタン配糖体を加水分解し対応するスピロスタン配糖体を与える特異的β-グルコシダーゼを検出、完全精製し、その内部ペプチドのアミノ酸配列情報を利用し、PCR法によりcDNAのクローニングに成功した。(2)ついでこのcDNAを大腸菌で活性酵素タンパクとして発現することにも成功し、タバコでの発現についても検討した。これらの結果は、高等植物におけるトリテルペンあるいはステロイドサポニン生合成の鍵反応を酵素レベルまた遺伝子レベルで明らかにした初めての例であり、今後のサポニン生産薬用植物の代謝工学的研究に大いに貢献するものである。

我们通过生物合成酶的检测、表征和基因克隆来研究皂苷生物合成。 1. 在人参的毛状根中，(1)我们研究了毛状根培养系统中皂苷产量的时间变化，发现具有齐墩果烷骨架的人参皂苷-Ro首先产生，并且从该时间开始减少，基于达玛烷的皂苷的产量开始增加，我发现了一个有趣的事实，它增加了。 (2)接下来，我们尝试检测氧化角鲨烯闭环酶并鉴定闭环产物，并检测了毛状根微粒体组分中的达玛烯二醇、β-香树脂醇和环阿烯醇三种类型的闭环酶活性。产品的HPLC分析表明，达玛烯二醇具有20-S的绝对构型，与天然皂苷相似。 (3)在三种类型的闭环活性中，达玛烯二醇合酶活性与其他两个物种或其他生物物种中报道的闭环酶不同，并且需要添加表面活性剂才能获得最大活性。它具有独特的特性，例如其最佳 pH 值呈酸性。 2、在鸢尾花的芽培养体系中，(1)检测并完全纯化出一种水解霜烷糖苷生成相应螺甾烷糖苷的特异性β-葡萄糖苷酶，并利用其内部肽的氨基酸序列信息的cDNA。采用PCR方法成功克隆。 (2)接下来，我们成功地在大肠杆菌中表达了该cDNA作为活性酶蛋白，并且我们还研究了其在烟草中的表达。这些结果首次在酶和基因水平上阐明了高等植物中三萜或类固醇皂苷生物合成的关键反应，将为未来产皂苷药用植物的代谢工程研究做出巨大贡献。

项目成果

Kentaro INOUE: "Conversion of furostanol glycoside to spirostanol glycoside by β-glnosidase in Costns Speciosus." Phytochemistry. 41(3). 725-727 (1996)

Kentaro INOUE：“Costns Speciosus 中的 β-糖苷酶将呋甾烷醇糖苷转化为螺甾烷醇糖苷”，41(3)。

Tetsuo KUSHIRO: "In vitro Conversion of 2,3-oxidosqwalene into dammarenediol by Panax ginseng microsomes." Biol.Pharm.Bull.20(in press). (1997)

Tetsuo KUSHIRO：“体外通过人参微粒体将 2,3-oxidosqwalene 转化为达玛烯二醇。”

Kentaro INOUE: "Purification and characterization of furostand glycoside 26-O-B-glncosidase from Costas speciosuo rhizomes." FEBS Letters. 378. 157-160 (1996)

Kentaro INOUE：“来自Costas spiosuo 根茎的呋喃糖苷26-O-B-葡萄糖苷酶的纯化和表征。”

Kentaro INOUE: "Molecular cloning and bacterial expression of a cDNA encoding furostanol glycoside 26-O-B-glncosidase of Costus speciosus." FEBS Letters. 389. 273-277 (1996)

Kentaro INOUE：“编码 Costus spiosus 呋甾醇糖苷 26-O-B-葡萄糖苷酶 cDNA 的分子克隆和细菌表达。”