多機能型生合成酵素を利用した天然物ライブラリーの構築

利用多功能生物合成酶构建天然产物库

• 批准号: 13877362
• 负责人: 海老塚 豊
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13877362/
• 关键词: 天然物; 光蔵多様性; トリテルペン; ポリケタイド; 生合成酵素; 形質転換植物; キメラ

(1)新規多機能型生合成酵索のクローニング熱帯産ショウガ科薬用植物Costus speciosus のin vitro培養植物体全草よりRNAを抽出、逆転写して得たcDNAを鋳型とし、既知オキシドスクワレン閉環酵素で保存されている配列を基にデザインした縮重プライマーを用いるPCRにより新規トリテルペン合成酵素をクローニングした。酵母における発現により本酵素はβ-Amyrinを含め最低6種の異なる骨格のトリテルペンを与える多機能型生合成酵素であることを証明した。(2)糸状菌由来ポリケタイド合成酵素間のキメラ型酵素作成とその機能解析Aspergillus nidulans由来ヘプタケタイド合成酵素WAとドメイン構造が全く同一のウリ類炭素病菌Colletotrichum lagenarium由来のペンタケタイド合成酵素PKS1とのキメラタンパクを作成した。このキメラ酵素をAsp.oryzaeで発現したところ、本来の生成物であるナフトピロンやT4HNは全く生産されず、既知のペンタケタイド2種及びヘキサケタイド1種の他、新規ヘキサケタイドの生産を確認し、目的とする多機能型生合成酵素の作成に成功した。また、微量ではあるがこれらの硫酸エステルの生産も確認したが、これらはホスト糸状菌による硫酸胞合体と考えられる。(3)生合成遺伝子導入植物の作成生合成遺伝子導入のモデルとして、ルペオール合成酵素をアンチセンス向きに組み込んだ形質転換用ベクターを作成し、シロイヌナズナを形質転換した。形質転換体を選抜、形質転換第2代目までの植物でトリテルペン系化合物を分析したところルペオール合成のみが選択的に抑制されていることが判明した。

（1）克隆一种新型的多功能生物合成发酵线。 Using the cDNA obtained by extracting RNA from the whole plant cultured in vitro of the tropical gingeraceae medicinal plant Costus speciosus, a reverse transcription, was used as a template, and then using a degenerate primer designed based on a sequence conserved with a known oxido-squalene ring-closing enzyme, the novel triterpene synthase was cloned by PCR using degenerate primers designed based on the sequence conserved带有已知的氧化平方环闭环酶。酵母中的表达证明，该酶是一种多功能生物合成酶，它赋予了至少六个不同的三萜骨架，包括β-氨基蛋白。 （2）从丝状真菌和它们的功能分析之间创建嵌合酶，我们从烟曲霉尼杜龙和五烷酸酯合成酶PKS1之间创建了嵌合蛋白，并从Cucumber碳病colletotrichum lagenar lagenar lagenarium，与之相同的结构结构。当这种嵌合酶以Asp.oryzae表达时，生产的原始产品均未产生含碳酮或T4HN，除了两种已知类型的五甲酰胺和一种类型的己酯，还确认了新的己酰胺的生产，并产生了所需的多功能生物合成的多功能enzyzyseme carried carried carried carried carried carried carried corried carried carried carried。此外，尽管这些硫酸盐的生产得到了少量证实，但被认为是宿主丝状真菌制造的硫酸盐环形。 （3）创建生物合成基因转移植物作为生物合成基因转移的模型，创建了一个转化载体，将lupeol合酶掺入反义中，并转化了拟南芥。选择转化子，并在第二代转化之前分析三萜化合物，并发现只有lupeol合成被选择性地抑制。

项目成果

N.Kawano: "Molecular Cloning and Functional Expression of cDNAs Encoding Oxidosqnalene Cyclrses from Costus speciosms"Boil. Pharm. Borll.. 25(4)(発売予定). (2002)

N.Kawano：“来自 Costus spiosms 的 cDNA 的分子克隆和功能表达”Boil.. 25(4)（待发布）。

A.Watanabe: "A Novel Hexaketide Naphthalene Synthesized by a chimeric Polyketide Synthase Composed of Fungal Pentaketide and Heptaketide Syntheses"Tetrahedron Lett.. 43. 843-846 (2002)

A.Watanabe：“由真菌五肽和七肽合成物组成的嵌合聚酮化合物合酶合成的新型六酮化合物萘”Tetrahedron Lett.. 43. 843-846 (2002)