多機能型生合成酵素を利用した天然物ライブラリーの構築

利用多功能生物合成酶构建天然产物库

• 批准号: 13877362
• 负责人: 海老塚 豊
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13877362/
• 关键词: 天然物; 光蔵多様性; トリテルペン; ポリケタイド; 生合成酵素; 形質転換植物; キメラ

(1)新規多機能型生合成酵索のクローニング熱帯産ショウガ科薬用植物Costus speciosus のin vitro培養植物体全草よりRNAを抽出、逆転写して得たcDNAを鋳型とし、既知オキシドスクワレン閉環酵素で保存されている配列を基にデザインした縮重プライマーを用いるPCRにより新規トリテルペン合成酵素をクローニングした。酵母における発現により本酵素はβ-Amyrinを含め最低6種の異なる骨格のトリテルペンを与える多機能型生合成酵素であることを証明した。(2)糸状菌由来ポリケタイド合成酵素間のキメラ型酵素作成とその機能解析Aspergillus nidulans由来ヘプタケタイド合成酵素WAとドメイン構造が全く同一のウリ類炭素病菌Colletotrichum lagenarium由来のペンタケタイド合成酵素PKS1とのキメラタンパクを作成した。このキメラ酵素をAsp.oryzaeで発現したところ、本来の生成物であるナフトピロンやT4HNは全く生産されず、既知のペンタケタイド2種及びヘキサケタイド1種の他、新規ヘキサケタイドの生産を確認し、目的とする多機能型生合成酵素の作成に成功した。また、微量ではあるがこれらの硫酸エステルの生産も確認したが、これらはホスト糸状菌による硫酸胞合体と考えられる。(3)生合成遺伝子導入植物の作成生合成遺伝子導入のモデルとして、ルペオール合成酵素をアンチセンス向きに組み込んだ形質転換用ベクターを作成し、シロイヌナズナを形質転換した。形質転換体を選抜、形質転換第2代目までの植物でトリテルペン系化合物を分析したところルペオール合成のみが選択的に抑制されていることが判明した。

(1)新型多功能生物合成发酵线的克隆从姜科热带药用植物木香全株体外培养的全株中提取RNA，以反转录得到的cDNA为模板，使用已知的氧化角鲨烯闭环酶，使用基于保守序列设计的简并引物，通过PCR克隆了一种新型三萜合酶。在酵母中的表达表明，该酶是一种多功能生物合成酶，可产生至少六种不同的三萜，包括 β-香树脂素。 (2)源自丝状真菌的聚酮合酶之间的嵌合酶的创建及其功能分析在源自构巢曲霉的七肽合酶WA和源自葫芦碳质真菌Colletotrichum lagenarium的五肽合酶PKS1之间构建了嵌合蛋白，其具有完全相同的功能。域结构已创建。当这种嵌合酶在 Asp 中表达时，我们成功地创建了一种多功能生物合成酶。我们还证实了这些硫酸酯的产生，尽管是微量的，但这些被认为是与宿主丝状真菌结合的硫酸盐孢子。 (3)导入生物合成基因的植物的制作作为生物合成基因导入的模型，制作以反义方向并入羽扇豆醇合酶的转化载体，并转化拟南芥。当选择转化体并对植物中直到第二代转化的三萜化合物进行分析时，发现只有羽扇豆醇的合成被选择性抑制。

项目成果

N.Kawano: "Molecular Cloning and Functional Expression of cDNAs Encoding Oxidosqnalene Cyclrses from Costus speciosms"Boil. Pharm. Borll.. 25(4)(発売予定). (2002)

N.Kawano：“来自 Costus spiosms 的 cDNA 的分子克隆和功能表达”Boil.. 25(4)（待发布）。

A.Watanabe: "A Novel Hexaketide Naphthalene Synthesized by a chimeric Polyketide Synthase Composed of Fungal Pentaketide and Heptaketide Syntheses"Tetrahedron Lett.. 43. 843-846 (2002)

A.Watanabe：“由真菌五肽和七肽合成物组成的嵌合聚酮化合物合酶合成的新型六酮化合物萘”Tetrahedron Lett.. 43. 843-846 (2002)