未知の細胞不死化に関与する遺伝子のクロ-ニング

克隆参与细胞永生化的未知基因

• 批准号: 02807165
• 负责人: 池田 正明
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02807165/
• 关键词: 不死化癌遺伝子; cDNAライブラリ-; アデノウイルスE1A; Teratocarcinoma; 遺伝子クロ-ニング

目的:不死化に関係する遺伝子(群)、特にDNA腫瘍ウイルスの不死化癌遺伝子(アデノウイルスE1A遺伝子)と一部同等の機能を持つ遺伝子(群)が未分化な胎児性癌細胞(Teratocarcinoma)で発現していることが既に示唆されており、またこの様な遺伝子が口腔癌の発生にも重要な役割を果たしている可能性は充分に考えられる。一般に不死化癌遺伝子は、ラット初代培養細胞を不死化するが、単独では樹立化培養細胞をトランスホ-ムできないため検出が困難である。そこで本研究では既知の不死化癌遺伝子E1Aの機能を一部欠失した変異遺伝子を用い、ラット初代培養細胞における不死化能を相補する未知の遺伝子をヒト胎児性癌細胞のcDNAライブラリ-からクロ-ニングすることを目的とした。結果:1、E1A蛋白質のC末領域を欠失した変異遺伝子はrasとの協同作用は野生型と同様に示したが、ラット新生仔腎初代培養細胞(BRK)の不死化能を全く示さなかった。2、前記のE1A変異遺伝子を動物細胞で発現可能なベクタ-に組み込んだヒト胎児性癌細胞のcDNAライブラリ-と共にBRK細胞に導入した結果、不死化したと考えられる細胞株を一株単離した。3.単離した細胞株からDNAを抽出し、サザンブロットをおこなった結果、cDNAライブラリ-由来のDNAが2コピ-組み込まれていることが確認された。4、細胞のDNAを適当な制限酵素で切断、環状化した後、大腸菌に導入し、大腸菌ベクタ-と共にcDNAを回収する事を試みた(プラスミドレスキュウ-法)。組み込まれている2コピ-のcDNAのうち1つを回収したが、E1A変異遺伝子と共にBRK細胞に再導入しても細胞の不死化は起こさなかった。残りの1コピ-については約10種類の制限酵素を用いてプラスミドレスキュウ-を行ったが、まだcDNAの回収には成功していない。

目的：与永生化相关的基因（群），特别是具有与DNA肿瘤病毒的永生化癌基因（腺病毒E1A基因）同等功能的基因（群），已经被认为是未分化的胚胎癌细胞（畸胎癌）。基因在口腔癌中表达，这些基因很可能在口腔癌的发生发展中发挥重要作用。永生化癌基因通常使原代培养的大鼠细胞永生化，但很难检测到，因为它们不能单独转化已建立的培养细胞。因此，在这项研究中，我们使用了部分删除了已知永生癌基因E1A功能的突变基因，从人胚胎癌细胞的cDNA文库中克隆了一个补充原代培养的大鼠细胞永生化能力的未知基因——目的是。是。结果： 1.缺乏E1A蛋白C末端区域的突变基因与野生型表现出相同的与ras的协同作用，但没有表现出任何使原代培养的大鼠新生肾细胞(BRK)永生化的能力。 2. 将上述E1A突变基因导入BRK细胞，同时将人胚胎癌细胞的cDNA文库整合到可在动物细胞中表达的载体中，结果分离出似乎已成为永生的细胞系. 3.从分离的细胞系中提取DNA并进行Southern印迹，结果确认来自cDNA文库的2个DNA拷贝已被整合。 4.用适当的限制性酶切割并环化细胞DNA后，将其导入大肠杆菌中，并尝试与大肠杆菌载体一起回收cDNA（质粒拯救法）。尽管两个整合的 cDNA 拷贝之一被回收，但与 E1A 突变基因一起重新引入 BRK 细胞并不会导致细胞永生化。使用大约 10 种不同的限制性酶对剩余的拷贝进行了质粒拯救，但 cDNA 回收尚未成功。