デスモゾーム構成蛋白遺伝子のクローニング

桥粒组成蛋白基因的克隆

基本信息

批准号：
63570479
负责人：
橋本隆
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ウシ鼻表皮より精製したデスモゾームをマウスに免疫し、ハイブリドーマ法により3種の異なった抗デスモゾーム単クローン抗体および高抗体価の抗血清を得た。マウス培養細胞抽出液の免疫ブロット解析によりこれらの抗体は240kDおよび220kDの蛋白を認識したことより、これらの抗体はデスモゾーム構成蛋白の一つであるデスモプラキンに対する抗体であり、また、この細胞は多量のデスモプラキンを産生していることが判明した。このマウス表皮細胞よりLiClを含んだバッファーを用いてtotal RNAを抽出し、oligo(dT)カラムによりpoly(A)^+RNAを精製した。ランダムプライマーを用いて逆転写酵素により1本鎖DNAとし、RNase HとDNA polymerase Iにより2本鎖DNAを合成後、T4DNA polymeraseにより末端を平滑化した。cDNAの内部EcoRI siteをメチル化した後EcoRIリンカーを連結し、発現ベクターλgt11に組みこんだ。in vitro packagingによりパッケージしcDNAライブラリーとした。デスモプラキン蛋白をコードするcDNAをクローニングするために、上記単クローン抗体および抗血清をプローベとしてcDNA発現ライブラリーを免疫スクリーニングした。すなわち、大腸菌Y1090を宿主として組み換えファージをプレート後42℃にて3ー4時間培養し、IPGTをしみこませたニトロセルロース膜をかぶせて37℃にて一晩培養した。大腸菌の産生する融合蛋白が移しとられたニトロセルロース膜を20%ウシ血清でブロック後、上記抗デスモゾーム抗体を1次抗体、アルカリホスファターゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗血清を2次抗体として反応させ発色させた。現在まで2×10^5の組み換えファージを免疫スクリーニングした結果、6コの陽性クローンを得た。現在、ノーザンブロット解析、エピトープ選択法、塩基配列解析等によりこれらのcDNAクローンを解析中である。

用从牛鼻表皮中纯化的脱糖体对小鼠进行免疫，并通过杂交瘤获得了三种不同的抗体化剂单克隆抗体和抗抗体滴度的抗血清。对小鼠培养的细胞提取物的免疫印迹分析表明，这些抗体识别为240 kD和220 kD的蛋白质，并且这些抗体是对脱莫普拉蛋白的抗体，脱氨基链霉素是脱糖体组成蛋白之一，并且这些细胞产生了大量的脱莫波拉金。使用含有LICL的缓冲液从小鼠表皮细胞中提取总RNA，并使用Oligo（DT）列纯化Poly（A）^+RNA。单链DNA使用逆转录酶使用随机底漆制成，并使用RNase H和DNA聚合酶I合成双链DNA，并被T4 DNA聚合酶钝化。在cDNA的内部ECORI位点的甲基化后，将ECORI连接器连接并掺入表达载体λgt11中。通过体外包装包装以形成cDNA库。为了克隆编码脱氨木蛋白的cDNA，使用单克隆抗体和抗溶质作为探针对cDNA表达文库进行免疫镜。也就是说，将重组噬菌体用大肠杆菌Y1090作为宿主铺板，并在42°C进行培养3-4小时，然后用IPGT浸泡的硝酸纤维素膜覆盖，并在37°C中培养。将硝酸纤维素膜转移到大肠杆菌产生的融合蛋白上后，用20％的牛血清封闭，上述抗脱胃小体抗体与原代抗体和碱性磷酸酶磷酸酶抗磷酸酶抗体免疫蛋白抗体反应反应。迄今为止，对2×10^5的重组噬菌体进行了免疫结合，导致六个阳性克隆。目前，通过Northern印迹分析，表位选择方法，基础序列分析等分析了这些cDNA克隆。