ヒトDNA修復遺伝子およびその蛋白の分子遺伝学的解析

人类DNA修复基因及其蛋白质的分子遗传学分析

基本信息

批准号：
01015057
负责人：
田中亀代次
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

色素性乾皮症(XP)A群の原因遺伝子をクローニングした(XPAC遺伝子)。XPACcDNAをプローブにして多数のA群XP患者のXPACゲノムおよびmRNAを調べた。サザンブロット解析では異常を認めなかったが、ノザンブロット解析では大部分の症例で著明なmRNA量の減少とサイズの異常を認めた。正常ヒト細胞より、EMBL3ベクターにXPACゲノムをクローニングし、エクソンの位置を決めた。XP2OSのA群XP細胞からもXPACゲノムをEMBL3にクローニングし、エクソンおよびエクソン・イントロン境界部の塩基配列を正常ヒト細胞のそれと比較した。その結果、XP2OSではイントロン3のスプライシングアクセプターAG__ーがAC__ーに点突然変異し、スプライシング異常がみつかった。しかも、AG__ー→AC__ー変異で新らしい制限酵素部位ができるので、この異常をサザンブロット解析で容易に調べることができる。その結果、20例の日本人A群XP患者のうち、19例がこの変異をもつことがわかつた。しかも、19例中16例は2つの対立遺伝子ともこの変異をもっていた。XP39OSではノザンブロット解析で正常のXPACmRNAが認められたが、cDNAの塩基配列の解析より、C__ーGA→T__ーGAのノンセンス突熱変異がホモで見つかった。そのため、短い(約80%長)XPAC蛋白がこの患者で生成されていることが予想された。XPACcDNAをT7ファージプロモーターを使用し、大腸菌内で大量生産させた。それをウサギに免疫し、XPAC蛋白に対するポリクローナル抗体を得た。蛍光抗体法で正常ヒト細胞を染色すると核が特異的に染色された。XP2OS細胞では核は染色されず、XPAC蛋白は生成されていないことがわかった。免疫沈降法では正常ヒト細胞で40ー42KDaのバンドが検出されたが、XP2OS細胞では認められなかった。

我们克隆了导致着色性干皮病 (XP) A 组的基因（XPAC 基因）。我们以XPAC cDNA为探针，对大量A组XP患者的XPAC基因组和mRNA进行了研究。 Southern blot分析未见异常，但Northern blot分析显示大多数情况下mRNA量显着减少且大小异常。将 XPAC 基因组克隆到来自正常人类细胞的 EMBL3 载体中，并确定外显子位置。 XP2OS A组XP细胞的XPAC基因组也被克隆到EMBL3中，并将外显子和外显子-内含子边界的核苷酸序列与正常人类细胞的核苷酸序列进行比较。结果，在XP2OS中，内含子3中的剪接受体AG__-突变为AC__-，导致剪接异常。此外，由于 AG__-→AC__- 突变产生了一个新的限制性酶位点，因此可以通过 Southern blot 分析轻松研究这种异常。结果，20名日本A组XP患者中，有19人被发现有这种突变。此外，19 例病例中有 16 例的两个等位基因均出现这种突变。在 XP39OS 中，通过 Northern blot 分析检测到正常的 XPAC mRNA，但 cDNA 碱基序列分析显示，在纯合子病例中存在 C__-GA→T__-GA 的无意义突然热突变。因此，预计该患者会产生短的（约 80% 长度）XPAC 蛋白。 XPAC cDNA 使用 T7 噬菌体启动子在大肠杆菌中大量生产。用其免疫家兔，获得抗XPAC蛋白的多克隆抗体。当使用荧光抗体法对正常人体细胞进行染色时，细胞核被特异性染色。在XP2OS细胞中，细胞核没有被染色，表明没有产生XPAC蛋白。在免疫沉淀中，在正常人细胞中检测到 40-42KDa 条带，但在 XP2OS 细胞中未检测到。