DNAトランスフェクション法による色素性乾皮症A群の遺伝子クローニング

DNA转染法克隆着色性干皮病A组基因

基本信息

批准号：
63015049
负责人：
田中亀代次
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

色素性乾皮症(XP)A群の遺伝子クローニングをDNAトランスフェクション法により行った。A群XP細胞はDNA修復能に異常をもち、紫外線(UV)に高感受性を示す。このA群XP細胞に、リン酸カルシウム共沈法によりマウスゲノムDNAをトランスフェクションし、マウスDNA修復遺伝子を取り込み、UV抵抗性を獲得したXP細胞を得た。さらにこのUV抵抗性XPトランスフェクタントに含まれるマウスDNA修復遺伝子を、マウス繰り返し配列をプローブにして、EMBL3ファージベクターにクローニングした。このクローニングした遺伝子は、他の2つの別家系のA群XPのDNA修復能も回復させることができたが、B、C、D、F、G群XPには無効でありA群特異的遺伝子であった。ついで、この遺伝子によってコードされるmRNAを、クローニングされた遺伝子の一部をプローブにしたノザンハイブリダイゼーションで調べた。供与体マウス細胞とUV抵抗性XPトランスフェクタントには約1KbのmRNAが、正常ヒト細胞では1.3Kbと1KbのmRNAが認められた。一方、異なる3家系のA群XP細胞には、これらのいずれのmRNAも認められなかった。これらのマウス及びヒトmRNAに対応するcDNAを、pcD_2Okayama-BcrgcDNAライブラリーよりクローニングした。A群XP細胞のDNA修復能を回復させ得る完全長cDNAクローンは、マウス、ヒトともに、約200万個に1個の割合でとれ、そのサイズは、マウス1Kb、ヒト1.4Kbであった。ヒトcDNAをプローブにして、A群XP細胞のゲノムDNA及びmRNAを調べた。サザンブロッティングでは、10家系のA群XPと正常者間に相異は認められなかったがサザンブロッティングでは、いずれのA群XPでも、1.4Kbと1KbのmRNAは欠損していた。B、C、D、F、G群XPでは正常者と変わらず、2つのmRNAが認められた。

采用DNA转染法对着色性干皮病（XP）A组进行基因克隆。 A 组 XP 细胞的 DNA 修复能力异常，并且对紫外线 (UV) 辐射高度敏感。采用磷酸钙共沉淀法将小鼠基因组DNA转染到这些A组XP细胞中，掺入小鼠DNA修复基因，获得获得抗紫外线能力的XP细胞。此外，使用小鼠重复序列作为探针，将这种抗紫外线 XP 转染子中包含的小鼠 DNA 修复基因克隆到 EMBL3 噬菌体载体中。这个克隆的基因也能够恢复另外两个独立家族的A组XP的DNA修复能力，但在B、C、D、F和G组XP中无效，表明A组特异性基因是。接下来，使用克隆基因的一部分作为探针，通过Northern杂交检查由该基因编码的mRNA。在供体小鼠细胞和抗紫外线 XP 转染子中发现了大约 1 Kb 的 mRNA，在正常人细胞中发现了 1.3 Kb 和 1 Kb 的 mRNA。另一方面，在来自三个不同家族的 A 组 XP 细胞中没有观察到这些 mRNA。从 pcD_2Okayama-Bcrg cDNA 文库中克隆了与这些小鼠和人类 mRNA 相对应的 cDNA。在小鼠和人类中，能够恢复 A 组 XP 细胞 DNA 修复能力的全长 cDNA 克隆的获得率约为 200 万分之一，其大小在小鼠中为 1 Kb，在人类中为 1.4 Kb。使用人 cDNA 作为探针研究 A 组 XP 细胞的基因组 DNA 和 mRNA。 Southern blotting显示10个家系A XP组与正常个体之间无差异，但Southern blotting显示所有A XP组均缺乏1.4Kb和1Kb mRNA。 B、C、D、F、G组XP中观察到2条mRNA，与正常人相同。