枯草菌σ^Dの多コピーproBによる転写後阻害とその阻害を回復させる遺伝子の単離

多拷贝 proB 对枯草芽孢杆菌 σ^D 的转录后抑制以及恢复这种抑制的基因的分离

基本信息

批准号：
08760100
负责人：
小倉光雄
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Tokai University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760100/
关键词：
Bacillus subtilis DNA結合タンパク質 sigma D fla che オペロン

项目摘要

枯草菌は菌体外に多量のプロテアーゼを生産分泌し、その制御は正のtwo-component制御系、DegS-Uによっており、さらに複数の制御因子が働いている。正の因子の一つDegRは、リン酸化DegUを安定化し、正のシグナルをプロテアーゼ遺伝子により強く伝達する。リン酸化型DegUが何らかの制御因子を介して、σ^Dに作用しDegR遺伝子発現を制御する現象を観察したので、トランスポゾンを用いた突然変異導入法によりこの制御分子の単離を試み、sud(suppressor of degR)と命名した変異株を得たので、その解析を目的とした。1.sud変異がσ^Dの構造遺伝子sigDを含むfla-cheオペロンの転写活性化を行っている可能性を検討した。sud変異とsigD-lacZを共存させてその発現を調べたところ、コントロールのsigD遺伝子発現に比較して約5倍程度高い発現が観察された。それゆえsud変異のdegR遺伝子発現に対する正の効果は、sigDの転写活性化によると考えられた。2.sud遺伝子を単離しその塩基配列を決定した。突然変異誘起に利用したトランスポゾンは選択に用いたsp耐性遺伝子と大腸菌で複製可能なoriを持っているので変異株の染色体DNAを制限酵素で切断後、リガーゼで処理し大腸菌に形質転換しトランスポゾン挿入点周囲のDNA約2600塩基対を単離した。プライマー伸長法とノーザンブロット法による解析で以下のことが判明した。sudは、2つのORFからなるオペロンで、上流ORFをsudK、下流ORFをsudLと命名した。SudKはGntR族、SudLはLacI-GalR族のDNA結合タンパク質にそれぞれ高い相同性を示した。degR遺伝子発現に影響するのはsudL ORFであり、sudK ORFの機能は不明であった。

枯草芽孢杆菌在细菌外产生并分泌大量蛋白酶，其对照是由阳性的两组分组调节系统，DEGS-U进行的，并且多个调节剂也在发挥作用。 DEGR的一个积极因素之一可以稳定磷酸化的DEGU，并通过蛋白酶基因强烈传输正信号。由于我们观察到了一种现象，其中磷酸化的DEGU通过一些调节因子对σ^d起作用并调节DEGR基因表达，因此我们试图使用转座子通过诱变来隔离该调节性分子，并获得了一个称为SUD的突变株SUD（DEGR的抑制器），这是分析的目的。 1。我们研究了SUD突变引起含有σ^d结构基因Sigd的Fla-Che操纵子的转录激活的可能性。当对SUD突变和SIGD-LACZ的表达共存并检查SIGD-LACZ时，该表达是对照中SIGD基因表达的五倍。因此，SUS突变对DEGR基因表达的积极作用被认为是由于SIGD的转录激活。 2。隔离SUD基因并确定其碱基序列。 The transposon used for mutagenesis has the sp resistance gene used for selection and the ori that can be replicated in E. coli, so the chromosomal DNA of the mutant strain was cleaved with a restriction enzyme, then treated with ligase to transform it into E. coli, and approximately 2,600 base pairs of DNA around the transposon insertion point were isolated.通过使用引物扩展和北印迹分析发现以下内容。 SUD是由两个ORF组成的操纵子，上游ORF被命名为Sudk，而下游的ORF称为Sudl。 Sudk分别与GNTR组和SUDL的DNA结合蛋白表现出很高的同源性。影响DEGR基因表达的是Sudl ORF，而Sudk Orf的功能尚不清楚。