自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明

阐明 ZCCHC3 激活 cGAS 的作用机制，这对先天免疫很重要

基本信息

批准号：
22K06546
负责人：
水口峰之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒトZCCHC3の大腸菌による大量発現系の構築を行った。全長ZCCHC3（1-403残基）のアミノ酸配列をコードするDNAを大腸菌用の発現ベクターに導入した。ZCCHC3は可溶化タグのLipoyl domainとの融合タンパク質として発現した。Lipoyl domainのN末端には精製用のHis-tagを付加した。Ni-NTA樹脂を用いてLipoyl domainとZCCHC3の融合タンパク質を精製し、その後TEVプロテアーゼでLipoyl domainとZCCHC3を切り離した。Lipoyl domainをNi-NTA樹脂で除去した後、ゲルろ過クロマトグラフィーでZCCHC3を精製した。LB培地800 mLの大腸菌培養液から、高純度のZCCHC3を十分量得ることに成功した。さらに、ZCCHC3の天然変性領域（1-160残基）の発現・精製にも取り組んだ。ZCCHC3の1-160残基のN末端にHis-tagを付加して大腸菌で発現し、Ni-NTA樹脂で精製したところ高純度のZCCHC3(1-160)を得ることができた。次に、ZCCHC3とDNAの相互作用をゲルシフトアッセイで調べた。その結果、天然変性領域の1-160残基フラグメントよりも全長ZCCHC3のほうがDNAに強く結合することがわかった。この実験では枯草菌由来の50 bpの二本鎖DNAを用いた。この枯草菌由来DNAは、自然免疫における重要なDNAセンサーであるcGASと複合体を形成し、cGASを活性化すると報告されている。また、cGASでもゲルシフトアッセイを行ったところ、枯草菌由来の二本鎖DNAに対する結合親和性は、ZCCHC3よりもcGASのほうが強いことが示された。さらに、ZCCHC3はHIV-1由来逆転写産物の一本鎖DNAのSL2領域と結合するが、SL2に対するZCCHC3の結合親和性は低いことがわかった。

我们利用大肠杆菌构建了人类 ZCCHC3 的大规模表达系统。将编码全长 ZCCHC3 氨基酸序列（残基 1-403）的 DNA 引入大肠杆菌表达载体中。 ZCCHC3 表达为带有溶解标签 Lipoyl 结构域的融合蛋白。用于纯化的 His 标签被添加到 Lipoyl 结构域的 N 末端。使用Ni-NTA树脂纯化Lipoyl结构域和ZCCHC3的融合蛋白，然后使用TEV蛋白酶分离Lipoyl结构域和ZCCHC3。用Ni-NTA树脂去除Lipoyl结构域后，通过凝胶过滤色谱法纯化ZCCHC3。我们成功地从 LB 培养基中的 800 mL 大肠杆菌培养物中获得了足够量的高纯度 ZCCHC3。此外，我们还研究了ZCCHC3自然简并区域（残基1-160）的表达和纯化。在大肠杆菌中表达的ZCCHC3的残基1-160的N末端添加His标签，并使用Ni-NTA树脂纯化，产生高纯度的ZCCHC3(1-160)。接下来，使用凝胶位移测定研究了 ZCCHC3 和 DNA 之间的相互作用。结果表明，全长 ZCCHC3 与 DNA 的结合比自然变性区域的 1-160 残基片段更强。在本实验中，使用来自枯草芽孢杆菌的 50 bp 双链 DNA。据报道，这种源自枯草芽孢杆菌的DNA与cGAS形成复合物，cGAS是先天免疫中重要的DNA传感器，并激活cGAS。对cGAS也进行了凝胶迁移分析，结果表明cGAS对枯草芽孢杆菌来源的双链DNA的结合亲和力比ZCCHC3更强。此外，ZCCHC3与HIV-1衍生的逆转录产物的单链DNA的SL2区域结合，但发现ZCCHC3与SL2的结合亲和力较低。